学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

微流控技术在联合应用FK506、NGF促进神经再生研究中的应用

作　者: 陈光
导　师: 吕德成
学　校: 大连医科大学
专　业: 骨外科学
关键词: 微流控芯片 PC12细胞 FK506 NGF 高通量药物筛选脊髓损伤神经再生
分类号: R651.2
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
下　载: 35次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

急性脊髓损伤（Acute Spinal Cord Injury,ASCI）是严重危害人类健康的一种疾病，随着社会的不断发展，其发病率不断上升，给患者的家庭和社会带来巨大的负担。脊髓损伤包括不可逆性的由由创伤机制所决定的原发性损伤和可逆性的继发性损伤。继发性脊髓损伤在损伤的脊髓组织及周围组织产生了一系列的病理反应，如出血、水肿、微循环障碍、局部组织氧自由基增多等改变，这些病理反应加重了脊髓组织的损伤，它所产生的损害远远超过原发性损伤。因此早期应用针对脊髓继发性损伤的有效药物治疗不可忽视。目前国内外研究的治疗药物主要集中在以下几类：皮质激素、神经营养因子（Neurotrophic factors, NTFS）、兴奋性氨基酸（Excitatory Amino acid,EAA）受体拮抗剂、钙通道拮抗剂（Calcium Channel Blockers）、抗氧化剂及自由基清除剂（Antioxidants and Free Radical Scavengers）、前列腺素（Prostaglandin,PG）、阿片受体拮抗剂（Opioid Receptor Antagonists）、环氧化酶（cyclooxygenase,COX）抑制剂和特异性COX-2抑制剂等。目前临床上公认的常用的有肯定疗效的药物是甲基强的松龙（MP）,在脊髓损伤后8小时内应用超大剂量的甲基强的松龙可以减轻脊髓损伤后继发性水肿，改善微循环，抑制脂质过氧化反应，减少氧自由基的生成，减轻钙离子内流，维持神经元的兴奋性，促进神经功能的恢复，从而避免了脊髓组织的进一步损伤。但甲基强的松龙的治疗时间仅限在伤后8小时以内，如在脊髓损伤8小时以后应用，不仅效果欠佳，并且会出现并发症。其他药物大部分只针对脊髓损伤的某一环节有效，而脊髓损伤的继发性损伤是多种机制共同作用的结果，所以治疗效果有限。因此联合不同作用机制的药物治疗脊髓损伤会成为今后的研究方向。近年来,随着高通量药物筛选技术的出现,为实现药物筛选的微量、快速和大规模目标开辟了新的途径，但其自身有一定的局限性。如以往实验室进行药物筛选多采用多孔板进行，不仅在实验过程中消耗的试剂量大，而且在实验样品的分配的过程中操作步骤十分的繁琐，而微流控芯片技术的出现则有可能克服高通量药物筛选的限制。微流控芯片技术是在微加工技术的基础上形成的，它之所以可以成为组织工程研究及药物筛选的新平台是因为其具有分析过程所消耗的试剂量少、分析速度快，并且本身易于集成和高通量分析等许多优点。他克莫司（Tacrolimus，FK506）是一种大环内酯类抗生素，具有极强的免疫抑制作用。新近研究表明，FK506具有保护大鼠脊髓损伤后的局部神经组织，促进神经再生，减少神经细胞凋亡，促进脊髓功能恢复等作用。神经生长因子（NGF）是神经营养因子（NTFS）家族中的一员，广泛分布于周围组织、外周神经系统和中枢神经系统。脊髓损伤后运动神经元可诱导NGFR表达，将外源性NGF注射到脊髓损伤部位，使NGF与NGFR相结合，可以保护神经元，促进轴突再生。研究证实FK506联合NGF在促进损伤的周围神经再生和营养神经的功能方面具有协同作用，在脊髓损伤的治疗中是否也具有相同的作用未见报道。本实验将微流控芯片技术引入到促神经再生研究领域，构建成以PC12细胞为效应细胞的促神经再生药物筛选体系，对FK506、NGF的促神经再生作用进行探索，并将二者联合应用治疗大鼠急性脊髓损伤，探讨二者在促进脊髓损伤后的功能恢复上是否具有协同作用。实验一微流控芯片的设计、制作及芯片上PC12细胞的培养目的：构建成集细胞培养、药物干预及蛋白检测为一体的微流控芯片检测平台。方法：以Jeon等提出的浓度梯度生成原理为基础，设计出一种由浓度梯度生成器（Concentration Gradient Generator,CGG）和细胞培养单元组成，适用于细胞水平的促神经再生药物筛选的微流控芯片。微流控芯片的基本材料为聚二甲基硅氧烷(PDMS)和载玻片， SU-8负胶母板是利用光刻工艺制作而成。母板制成后将聚二甲基硅氧烷采用浇筑法制成含有微通道的基片，并将基片等离子活化后封接到载玻片上，从而制成完整的微流控细胞培养芯片。在芯片上培养PC12细胞，观察细胞生长、增殖情况。结果：构建成由上游的浓度梯度生成器（Concentration GradientGenerator,CGG）和下游的细胞培养单元组成的微流控芯片。实现了芯片上细胞培养。结论：在微流控芯片上可成功实现细胞培养，为进一步的药物干预，及蛋白检测提供可靠的检测平台。实验二运用微流控芯片探讨FK506、NGF对PC12细胞轴突生长的影响目的：基于微流控芯片检测平台及PC12细胞，构建成促神经生长药物筛选体系，对FK506、NGF的促神经再生作用进行探索，为二者联合应用治疗神经损伤提供理论依据。方法：利用三个不同的微流控芯片上的浓度梯度生成器生成不同的FK506、NGF以及二者联合的浓度梯度，作用于芯片上细胞培养单元中培养的PC12细胞48小时，采用免疫荧光细胞化学的方法测定PC12细胞NF200表达情况以反映其轴突生长程度，以此筛选出FK506、NGF促进PC12细胞轴突生长的最佳药物配伍浓度。为了验证实验结果的准确性及有效性，我们在相同实验条件下采用多孔板法进行实验加以验证。结果：FK506在200nM的浓度下使PC12细胞NF200表达最强，NGF在50ng/mL的浓度下使PC12细胞NF200表达最强，FK506（114.29nM）与NGF（21.43ng/mL）的组合使PC12细胞NF200表达最强，轴突产生最大的生长效应。与多孔板法进行比较显示两种结果无明显差异（P>0.05）。结论：联合应用FK506、NGF在促进PC12细胞轴突生长中具有协同作用，FK506（114.29nM）与NGF（21.43ng/mL）的组合在PC12细胞轴突生长中具有最大促进作用。与传统检测平台相比，微流控芯片具有分析过程中所消耗的试剂量少、分析速度快，并且本身易于集成和高通量分析等许多优点。实验三联合应用FK506、NGF治疗大鼠脊髓损伤的实验研究目的：观察联合应用FK506、NGF对大鼠脊髓损伤后神经再生及功能恢复的影响。方法：120只SD大鼠随机分成损伤对照组、FK506治疗组、NGF治疗组、FK506联合NGF治疗组，假手术组。采用A1len’s法制造大鼠急性脊髓损伤模型，于造模后30分钟各治疗组分别予FK506（0.3mg/kg），NGF（40ug/kg），FK506+NGF（0.3mg/kg+40ug/kg）腹腔注射治疗，以后每日一次，持续治疗一周。大鼠脊髓损伤后的第3、7、14，21天采用HE染色观察脊髓组织病理变化，采用免疫组织化学方法检测NF200表达情况，采用RT-PCR方法检测NF200mRNA表达情况，并且采用BBB评分观察脊髓功能恢复情况。结果：伤后第7、14、21天，各治疗组在BBB评分、NF200表达，NF200mRNA表达上均高于损伤对照组，具有统计学差异（P＜0.05），其中联合治疗组明显优于其它治疗组，结果具有统计学差异（P＜0.05）。结论：联合应用FK506、NGF治疗大鼠脊髓损伤具有协同作用，可有效促进大鼠脊髓损伤后神经再生及功能恢复。

全文目录

摘要  9-13
Abstract  13-18
实验一微流控芯片的设计、制作及芯片上 PC12 细胞的培养  18-32
  前言  18-19
  材料与方法  19-22
    1. 材料  19-20
      1.1 细胞株  19
      1.2 主要仪器与设备  19
      1.3 主要试剂  19
      1.4 主要试剂配制  19-20
    2. 方法  20-22
      2.1 微流控芯片的设计  20
      2.2 微流控芯片的制作  20
      2.3 微流控芯片使用前的处理  20
      2.4 利用细胞培养瓶对 PC12 细胞进行常规培养  20-21
      2.5 微流控芯片上对 PC12 细胞进行培养  21
      2.6 PC12 细胞活性检测  21-22
  结果  22-24
    1. 微流控芯片的设计与制作  22-23
    2. 微流控芯片细胞培养  23-24
  讨论  24-27
  结论  27-28
  参考文献  28-32
实验二运用微流控芯片探讨 FK506、NGF 对 PC12 细胞轴突生长的影响  32-45
  前言  32
  材料和方法  32-35
    1. 材料  32-33
      1.1 细胞株  32
      1.2 主要仪器与设备  32-33
      1.3 主要试剂  33
      1.4 主要试剂配制  33
    2. 方法  33-35
      2.1 微流控芯片的设计、制作  33
      2.2 微流控芯片细胞培养及药物干预  33-34
      2.3 在微流控芯片上采用免疫细胞化学方法检测 PC12 细胞 NF200 表  34-35
      2.4 常规多孔板(96 孔板)法进行的平行试验  35
      2.5 统计学分析  35
  结果  35-37
    1. 微流控芯片上免疫细胞化学方法检测 PC12 细胞 NF200 表达情况  35-37
    2. 两种检测平台上进行的免疫细胞化学方法检测 PC12 细胞NF200 表达情况的结果对比  37
    3. 两种检测平台上进行的免疫细胞化学方法检测 PC12 细胞NF200 表达情况试剂消耗量对比  37
  讨论  37-41
  结论  41-42
  参考文献  42-45
实验三联合应用 FK506、NGF 治疗大鼠脊髓损伤的实验研究  45-65
  前言  45-46
  材料和方法  46-51
    1. 材料  46-47
      1.1 实验动物  46
      1.2 主要试剂  46
      1.3 主要试剂配制  46-47
      1.4 主要仪器  47
    2. 方法  47-51
      2.1 动物分组及脊髓损伤模型制备  47-48
      2.2 损伤区样本处理  48
      2.3 脊髓组织病理学观察  48
      2.4 免疫组化检测 NF200 表达  48-49
      2.5 RT-PCR 检测 NF200mRNA 表达  49-50
      2.6 应用 BBB 评分对各组大鼠脊髓功能恢复情况进行评估  50-51
      2.7 统计学分析  51
  结果  51-55
    1. 脊髓组织病理学改变  51-52
    2 脊髓损伤后 NF200 表达情况  52-54
    3 脊髓损伤后运动功能恢复情况  54-55
  讨论  55-59
  结论  59-60
  参考文献  60-65
综述  65-79
  参考文献  73-79
附录  79-81
攻读学位期间发表文章情况  81-82
致谢  82-83

微流控技术在联合应用FK506、NGF促进神经再生研究中的应用

内容摘要

全文目录

相似论文