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HIF-1α特异性小干扰RNA抑制糖尿病大鼠视网膜HIF-1α表达的研究

作　者: 刘艳
导　师: 陈松
学　校: 天津医科大学
专　业: 眼科学
关键词: 糖尿病视网膜病变缺氧诱导因子-1α 小干扰RNA 视网膜新生血管基因治疗
分类号: R587.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

目的以pSilencer2.1-U6neo为质粒载体,构建缺氧诱导因子-1α (HIF-1α)特异性小干扰RNA (siRNA),研究其对糖尿病大鼠视网膜HIF-1α表达的影响。观察玻璃体腔注射HIF-1α siRNA后不同时间糖尿病大鼠视网膜表达HIF-1α的变化情况。方法1.构建HIF-1α特异性siRNA重组质粒。SD大鼠共100只,随机分成正常组(A)组(21只)和糖尿病组(79只)。链脲佐菌素(STZ)尾静脉注射制作糖尿病大鼠模型。饲养18周后,FITC-Dextran荧光造影视网膜铺片证实DR模型成功后,糖尿病大鼠又随机分成对照(B)组、空载体(C)组和基因治疗(D)组。向空载体组玻璃体腔注射pSilencer空载体质粒,基因治疗组玻璃体腔注射HIF-1α特异性siRNA重组质粒。根据玻璃体腔注射后24小时、48小时和72小时,A、 B、C、D各组随机分成三个组。2.分别于注药后24小时、48小时、72小时后处死相应组动物,摘除眼球,应用组织病理学观察不同时间点各组大鼠视网膜的病理改变。采用实时荧光RT-PCR法检测各组视网膜HIF-1α mRNA水平的差异；免疫组化SP法观察视网膜各层HIF-1蛋白的染色情况。Image-Pro Plus6.0图像处理分析软件分析各组染色阳性区的平均累积光密度(integrated optic density,IOD)。3.运用SPSS11.5统计软件,经正态性检验及方差齐性检验,对同一组间不同时间,同一时间不同组间数据进行分析,采用单因素方差分析,并用SNK检验进行组间比较,P<0.05差异具有统计学意义。结果1.STZ诱导的糖尿病大鼠高血糖状态持久稳定,表现为明显的“三多一少”典型症状。在各时间点,正常组与糖尿病组大鼠体重、血糖均有统计学差异(P<0.05)。2. FITC-Dextran荧光造影视网膜铺片显示糖尿病组视网膜血管形态和分布发生明显改变,可见微血管瘤及异常吻合的新生血管团、高荧光素渗漏和无灌注区,证实DR模型制作成功。正常大鼠视网膜血管走行良好,视网膜浅层大血管及深层血管网均清晰可见,未见视网膜微血管瘤形成和视网膜新生血管形成。3.实时荧光RT-PCR结果显示,同一时间点C组和B组视网膜HIF-1α mRNA表达较A组明显上调,D组视网膜组织中HIF-1α mRNA较B组、C组下调,差异具有统计学意义(P<0.05),B组和C组表达差异无统计学意义(P>0.05)。D组不同时间点视网膜HIF-1α mRNA的表达差异具有统计学差异(F=9.437,P=0.002)。进一步进行组间比较,玻璃体腔注射HIF-1α siRNA48小时及72小时后视网膜HIF-1α mRNA表达较注射24小时后明显减少(P1=0.003,P2=0.001),注射72小时后较注射48小时后视网膜HIF-1αamRNA表达差异不具有统计学意义(P=0.749)。HIF-1α siRNA干扰24小时、48小时和72小时的抑制效率分别为32.59%、46.92%和52.28%。4. HIF-1α蛋白在正常大鼠视网膜神经节细胞层和外丛状层有少量阳性染色细胞,糖尿病组染色阳性细胞数表达增多,主要位于视网膜神经节细胞层、内丛状层、内核层、外丛状层。同一时间点C组和B组视网膜HIF-1α染色阳性区的平均IOD较正常组明显上调(P<0.05),B组和C组表达差异无统计学意义(P>0.05),D组视网膜组织中HIF-1α蛋白染色阳性区的平均IOD较B、C组下调,差异具有统计学意义(P<0.05)。D组不同时间点视网膜HIF-1α蛋白的表达差异具有统计学差异(F=26.373,P=0.000)。进一步进行组间比较,玻璃体腔注射HIF-1α siRNA48小时及72小时后视网膜HIF-1a蛋白表达较24小时明显减少(P1=0.000,P2=0.000),注射72小时后较注射48小时后视网膜HIF-1α蛋白表达差异不具有统计学意义(P=0.215)。结论本实验构建HIF-1α特异性siRNA重组质粒,将HIF-1α siRNA成功的转染至大鼠视网膜,通过实时荧光RT-PCR和免疫组织化学染色方法观察糖尿病大鼠视网膜HIF-1α的表达,发现HIF-1α特异性siRNA降低了糖尿病大鼠视网膜HIF-1α的表达,从而有望抑制其靶基因VEGF等促进血管新生因子的表达,抑制视网膜新生血管的形成,成为治疗DR的一种新的途径。

HIF-1α特异性小干扰RNA抑制糖尿病大鼠视网膜HIF-1α表达的研究

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