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基于ApoE基因敲除小鼠的动脉硬化研究

作　者: 王敏
导　师: 谭孟群
学　校: 中南大学
专　业: 生理学
关键词: 动脉粥样硬化 腺相关病毒 基因治疗 内皮祖细胞
分类号: R543.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
下　载: 22次
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内容摘要


目的：动脉粥样硬化发生机制复杂。目前AS的主要治疗方法是手术治疗和他汀药物治疗,手术可缓解组织缺血但无法改变AS病程,他汀药物可降低血清LDL-C水平但对人体存在一些副作用。本课题组拟采用基因或细胞干预的方式对动脉粥样硬化模型小鼠进行治疗并检测评估其效果,致力于寻找更好的治疗方案。方法与结果：高脂饲料喂养ApoE-/-小鼠四个月,饲养前后分别称量小鼠体重、检测血脂水平,处死部分小鼠后取腹主动脉和肝脏,HE染色观察组织结构改变。结果显示：高脂饲养组小鼠体重减轻；血脂明显上升；腹主动脉内膜增厚,有斑块形成；肝脏结构紊乱,大部分肝细胞肿胀呈气球样变,并可见肝细胞空泡变性。结果表明动脉粥样硬化小鼠模型建立成功。采用PEI方法,三质粒共转染HEK293细胞,分别包装了rAAV-PON1、rAAV-PON1-ApoAl两种病毒并用超速离心层析法对其纯化,real-time PCR法检测其滴度,转染MSCs检测其活性。结果表明本实验获得了较高纯度、较高滴度和较好活性的病毒,可用于后续实验。采用全骨髓贴壁法体外培养C57BL、6小鼠EPCs。显微镜下观察培养的EPCs细胞形态成鹅卵石状；免疫组化检测vWF和flk-1表达为阳性；免疫荧光鉴定结果表明所培养细胞具有吞噬Dil-ac-LDL和摄取FITC-UEA-1的能力,可用于对动脉粥样硬化模型小鼠进行细胞治疗。将rAAV-PON1、rAAV-PON1-ApoA1、 EPCs分别经尾静脉注射到模型小鼠体内。治疗四个月后,检测小鼠体重、血脂水平,real-time PCR法检测ApoA1、PON1、eNOS、CRP基因表达,Western-blot法检测人PON1蛋白在小鼠体内的表达,HE染色观察腹主动脉和肝脏组织结构,免疫组织化学染色法测定a-actin和MAC-3表达。结果表明单、双基因和EPCs对AS都起一定干预作用,其中单基因效果优于其它组,干预效果最为明显。结论：本课题组建立了动脉粥样硬化小鼠模型,体外分离并培养了与模型鼠同品系的C57BL/6小鼠的EPCs,包装了重组腺相关病毒,采用基因干预和细胞干预分别对模型小鼠进行治疗。研究结果表明rAAV-PON1、rAAV-PON1-ApoAl和EPCs对动脉粥样硬化小鼠都有一定的干预效果。其中单基因治疗效果最好。

全文目录


摘要  4-6
Abstract  6-12
英文缩略词表  12-14
前言  14-19
第一章 动脉粥样硬化小鼠模型的建立  19-27
  1.1 材料与方法  20-22
    1.1.1 试剂与仪器  20-21
    1.1.2 实验方法  21-22
  1.2 实验结果  22-26
    1.2.1 体重变化  22-23
    1.2.2 血脂变化  23-24
    1.2.3 腹主动脉和肝脏HE染色结果  24-26
  1.3 本章小结  26
  1.4 讨论  26-27
第二章 携带单、双基因的重组腺相关病毒的包装及纯化  27-36
  2.1 材料与方法  27-32
    2.1.1 材料与仪器  27-29
    2.1.2 实验方法  29-32
  2.2 实验结果  32-34
    2.2.1 质粒提取与鉴定  32
    2.2.2 HEK293T细胞的培养和转染  32-33
    2.2.3 Real-time PCR检测病毒滴度结果  33-34
    2.2.4 AAV病毒活性检测  34
  2.3 本章小结  34-35
  2.4 讨论  35-36
第三章 C57BL/6小鼠EPCs的分离、培养和鉴定  36-44
  3.1 材料与试剂  37-38
    3.1.1 实验试剂  37
    3.1.2 试剂配制  37-38
    3.1.3 动物标本  38
    3.1.4 实验仪器  38
  3.2 实验方法  38-40
    3.2.1 骨髓EPCs的分离、培养  38
    3.2.2 内皮祖细胞形态学观察  38-39
    3.2.3 MTT法测内皮祖细胞生长曲线  39
    3.2.4 荧光吞噬试验  39
    3.2.5 流式表型检测表面抗原表达  39
    3.2.6 免疫组化检测Flk-1和vWF表达  39-40
  3.3 实验结果  40-42
    3.3.1 EPCs的培养和形态学观察  40
    3.3.2 EPCs生长曲线测定  40-41
    3.3.3 EPCs的表型鉴定  41
    3.3.4 荧光吞噬实验结果  41
    3.3.5 免疫组化检测vWF和Flk-1抗原表达  41-42
  3.4 本章小结  42
  3.5 讨论  42-44
第四章 细胞治疗、基因治疗对动脉硬化小鼠的效果评估  44-61
  4.1 材料与试剂  45-47
    4.1.1 主要试剂  45
    4.1.2 细胞选择  45
    4.1.3 实验动物  45
    4.1.4 实验引物  45-46
    4.1.5 试剂配制  46
    4.1.6 实验仪器  46-47
  4.2 实验方法  47-50
    4.2.1 动脉粥样硬化模型的建立  47
    4.2.2 实验分组  47
    4.2.3 内皮祖细胞的培养  47
    4.2.4 CM-Dil标记EPCs  47
    4.2.5 分组实验  47-48
    4.2.6 动物标本采集  48
    4.2.7 血脂检测  48
    4.2.8 Real-time PCR检测目的基因和AS相关基因表达  48-49
    4.2.9 免疫印迹法半定量测定hPON1蛋白含量  49-50
    4.2.10 免疫组织化学染色  50
    4.2.11 统计学处理实验数据  50
  4.3 结果  50-59
    4.3.1 小鼠动脉粥样硬化模型  50
    4.3.2 EPCs的培养和标记  50-51
    4.3.3 治疗后血脂变化  51-52
    4.3.4 基因在肝脏组织内的表达  52-55
    4.3.5 相关蛋白表达检测结果  55-56
    4.3.6 肝脏和腹主动脉病理学观察  56-59
  4.4 本章小结  59
  4.5 讨论  59-61
综述  61-68
参考文献  68-77
攻读学位期间已发表研究成果  77-78
致谢  78

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中图分类: > 医药、卫生 > 内科学 > 心脏、血管（循环系）疾病 > 血管疾病 > 动脉疾病
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