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靶向沉默Notch-1的腺相关病毒载体的构建及其对人胶质瘤肿瘤干细胞成瘤性的影响

作　者: 任松涛
导　师: 姚维成
学　校: 青岛大学
专　业: 神经外科
关键词: Notch-1基因重组腺相关病毒胶质瘤肿瘤干细胞裸鼠
分类号: R739.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目的构建一个靶向Notch-1基因的rAAVl-shRNA载体,以阻断Notch-1基因的表达,观察沉默Notch-1基因后人胶质瘤肿瘤干细胞在裸鼠体内成瘤性的影响。方法设计针对Notch-1基因的靶DNA序列,构建pAAV-MCS2/siRNA-Notch-1的重组质粒,将该质粒和腺相关病毒包装质粒pAAV-RC,腺病毒辅助质粒pHelper共转染QBI-293A细胞,包装成带有Notch-1基因的重组腺相关病毒。用无血清培养法从人胶质瘤细胞株U251中培养分离出肿瘤干细胞,以最适感染复数(MOI)感染肿瘤干细胞。将细胞分为三组：rAAV-EGFP-Notch-1转染组、空载体(rAAV-EGFP)转染组和未转染病毒的空白对照组,然后将每组细胞悬液分别注射裸鼠5只,观察其成瘤性情况,20天后处死动物,常规石蜡组织切片进行Notch-1的免疫组化染色测定。结果PCR鉴定分析结果表明成功构建了针对Notch-1的siRNA重组腺相关病毒载体,滴定法测定重组病毒载体基因组得到滴度为1.2×1012VP/L的高滴度腺相关病毒。用无血清培养法在胶质瘤细胞株U251中成功分离出肿瘤干细胞,免疫荧光监测显示该细胞CD133和Nestin的表达呈阳性。裸鼠的体内致瘤性实验显示rAAV-EGFP-Notch-1转染组肿瘤体积显著小于另外两组,说明肿瘤生长受到抑制,免疫组化结果显示该组肿瘤组织的Notch-1蛋白的表达亦有明显降低。结论成功构建携带Notch-1基因短发夹状干扰RNA的腺相关病毒载体,为下一步探索Notch-1基因在胶质母细胞瘤肿瘤干细胞中的作用提供实验基础。靶向阻断Notch-1基因可以有效抑制人胶质瘤U251肿瘤干细胞裸鼠皮下肿瘤的生长,这为胶质瘤的治疗提供新的思路。

全文目录

中文摘要  2-3
Abstract  3-5
引言  5-6
第一章实验材料与方法  6-13
  1.1 实验材料  6-7
    1.1.1 主要细胞系  6
    1.1.2 主要试剂  6
    1.1.3 主要仪器  6-7
  1.2 实验方法  7-13
    1.2.1 腺相关病毒载体的制备  7-8
    1.2.2 肿瘤细胞的培养  8-9
    1.2.3 肿瘤干细胞的诱导分化及鉴定  9-10
    1.2.4 细胞转染  10
    1.2.5 裸鼠致瘤性改变  10-11
    1.2.6 免疫组化分析  11-12
    1.2.7 统计学方法  12-13
第二章结果  13-15
  2.1 质粒pAAV-MCS的改建  13
  2.2 重组质粒pAAV-MCS2/siRNA-Notch-1的构建及酶切结果  13
  2.3 重组AAV-siRNA-Notch-1病毒感染QBI-293A细胞的鉴定  13
  2.4 细胞培养及肿瘤干细胞的诱导形成  13-14
  2.5 干细胞特异标志物的免疫荧光鉴定  14
  2.6 裸鼠肿瘤生长情况  14
  2.7 免疫组化情况  14-15
第三章讨论  15-18
结论  18-19
参考文献  19-21
附图  21-27
综述  27-39
  综述参考文献  36-39
攻读学位期间研究成果  39-40
致谢  40-41

靶向沉默Notch-1的腺相关病毒载体的构建及其对人胶质瘤肿瘤干细胞成瘤性的影响

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