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肺脏上皮细胞中Wnt/β-catenin负反馈调节BCG诱发TLR信号活性的作用机制研究

作　者: 石娟
导　师: 刘晓明；李勇
学　校: 宁夏大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 肺脏上皮细胞 Wnt/β-catenin信号结核分枝杆菌炎症反应 Toll样受体信号
分类号: R52
类　型: 硕士论文
年　份: 2014年
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内容摘要

结核分枝杆菌(Mycobacterium Tuberculosis,Mtb)是典型的胞内寄生菌,肺泡巨噬细胞作为免疫调节细胞和效应细胞,在感染过程中通过吞噬、抗原递呈和分泌多种细胞因子等功能来调控机体炎症反应和免疫应答。近年来研究发现,肺泡Ⅱ型上皮细胞(Alveolar epithelial type II cells, AECⅡ)与巨噬细胞一样也是结核病原菌最先侵染的靶细胞；AECⅡ除了在肺脏的正常细胞更新和损伤修复过程中可增殖分化为肺泡Ⅰ型和Ⅱ型上皮细胞,并合成和分泌肺表面活性物质,维持肺泡内外液体平衡,还在肺脏抵御外源微生物感染中具有重要的免疫调节的作用,这一作用使AECⅡ细胞成为人们研究的热点之一。在AECⅡ细胞应对外源微生物(如结核分枝杆菌)感染中,受到多种信号网络的复杂调控,具体的调控机制仍在研究和探讨中。而作为参与组织特化和细胞迁移等发育过程的关键Wnt信号通路在肺脏感染结核分枝杆菌的过程中,其所在AECⅡ细胞中是否也对先天免疫发挥了重要的调控作用,目前尚未见到报道。因此,本研究以Ⅱ型肺泡上皮细胞A549细胞为模型,分析其在牛结核分枝杆菌卡介苗(BCG)和脂多糖(LPS)的刺激前后Wnt/β-catenin信号通路相关信号和炎症因子的变化,以及与Toll-like recepters信号通间的相互作用,以此来探讨Wnt信号通路在机体抗结核分枝杆菌感染中AECII细胞的免疫调控作用。通过试验,获得以下结果：1.A549细胞在BCG和LPS刺激时,通过上调Axin和GSK3β的表达来抑制了β-catenin、LEF-1和TCF4的表达,从而抑制了Wnt/β-catenin信号通路的活性；2.A549细胞在BCG和LPS刺激后,Toll信号通路中MyD88、TRAF6和NF-kb发生上调,导致炎症因子IL-6、IL-2、IL-8、TNF-a分泌增加；而在A549细胞中过表达β-catenin或添加Wnt3a条件培养基时,其炎症因子和TLR信号通路相关因子下调,这表明在肺泡上皮细胞中,Wnt信号对BCG和LPS刺激引起的炎症反应具有抑制作用,从而保护细胞免受过度炎性反应的损伤；3.在A549细胞中过表达TLR信号通路中的关键因子MyD88后,Wnt信号通路中P-catenin、FZD-1和cyclinD1的表达均发生下调,这表明TLR信号通路对Wnt/β-catenin信号通路的活化具有抑制作用。综上所述,肺泡上皮细胞在BCG和LPS刺激时是通过Wnt/β-catenin和TLR信号通路间的负反馈调控来维持炎症反应的平衡。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-9
目录  9-11
第一章文献综述  11-23
  1.1 Wnt信号通路  11-13
    1.1.1 Wnt蛋白  11
    1.1.2 经典Wnt信号途径  11
    1.1.3 非经典Wnt信号途径  11-12
    1.1.4 Wnt蛋白与Wnt信号通路  12-13
  1.2 Wnt信号在免疫调节中的作用  13-15
    1.2.1 Wnt信号通路在炎症反应中作为一个古老通路中的新角色  13-14
    1.2.2 Wnt3a和Wnt5a作为两个标准型Wnts在小鼠骨髓巨噬细胞Wnt/β-catenin信号中起着相反的作用  14-15
    1.2.3 Wnt信号在巨噬细胞中的调节作用  15
  1.3 肺脏上皮细胞的介绍  15-16
  1.4 肺脏上皮细胞中经典Wnt信号的研究进展  16-17
  1.5 结核分枝杆菌的介绍  17
  1.6  17-20
    1.6.1 TLR信号通路介绍  17-18
    1.6.2 TLR信号通路受体  18
    1.6.3 TLRs介导的信号通路  18-19
    1.6.4 MyD88  19
    1.6.5 MyD88依赖信号通路与MyD88非依赖信号通路  19-20
  1.7 在结核分枝杆菌感染中Wnt/β-catenin信号通路和炎症反应相互的调节作用  20-21
  1.8 本课题研究意义  21-23
第二章结核分枝杆菌刺激对肺脏上皮细胞Wnt/β-catenin信号途径的影响  23-36
  引言  23
  2.1 实验材料  23-24
    2.1.1 细胞系  23
    2.1.2 使用仪器  23-24
    2.1.3 主要试剂与载体  24
  2.2 实验步骤与方法  24-31
    2.2.1 人肺脏上皮细胞A549细胞的培养  24-25
    2.2.2 用于X-gal染色对A549细胞的转染  25
    2.2.3 X-gal染色液配制  25-26
    2.2.4 X-gal染色步骤  26
    2.2.5 用于双荧光素酶检测对A549细胞的转染  26
    2.2.6 双荧光素酶报告基因检测方法  26
    2.2.7 人肺脏上皮细胞A549 RNA的提取及浓度测定  26-27
    2.2.8 cDNA的构建  27
    2.2.9 Real Time PCR  27-28
    2.2.10 对目的基因PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测分析  28
    2.2.11 细胞全蛋白提取  28-29
    2.2.12 根据试剂盒说明提取细胞胞浆蛋白和细胞核蛋白  29-30
    2.2.13 测定不同处理A549细胞蛋白浓度  30
    2.2.14 蛋白质印迹检测  30-31
    2.2.15 MTT  31
  2.3 实验结果  31-34
    2.3.1 A549细胞转染结果  31-32
    2.3.2 β-半乳糖苷酶在A549细胞中的表达情况  32
    2.3.3 BCG和LPS刺激抑制上皮细胞中的经典Wnt信号活性  32-33
    2.3.4 BCG感染对A549细胞中Wnt信号家族相关因子表达的影响  33-34
    2.3.5 BCG感染对A549细胞中Wnt信号家族相关蛋白表达的影响  34
  2.4 讨论  34-36
第三章 Wnt/β-catenin信号途径对肺脏上皮细胞抗结核分枝杆菌感染中炎性反应的作用及调控机制  36-41
  引言  36
  3.1 实验材料  36-37
    3.1.1 细胞系  36
    3.1.2 使用仪器  36-37
    3.1.3 主要试剂  37
  3.2 实验步骤和方法  37-38
    3.2.1 人肺脏上皮细胞A549细胞的培养  37
    3.2.2 双荧光素酶检测分析  37
    3.2.3 qPCR  37
    3.2.4 WesternBlot  37
    3.2.5 ELISA  37-38
  3.3 实验结果  38-39
    3.3.1 Wnt/β-catenin负调控A549细胞中BCG和LPS刺激诱导的细胞炎症反应  38-39
    3.3.2 在肺脏上皮细胞A549中MyD88抑制Wnt/β-catenin信号通路  39
  3.4 讨论  39-41
结论  41-42
参考文献  42-51
附录  51-54
致谢  54-55
个人简介  55

肺脏上皮细胞中Wnt/β-catenin负反馈调节BCG诱发TLR信号活性的作用机制研究

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