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人可溶性DC-SIGN单多抗双夹心ELISA检测体系的建立和初步应用

作　者: 张婧
导　师: 陈政良
学　校: 南方医科大学
专　业: 免疫学
关键词: 重组质粒 PET17b-sDC-SIGN 双夹心 ELISA
分类号: R446.6
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

树突状细胞(Dendritic cell,DC)是目前研究所知体内功能最强大的专职抗原提呈细胞,其既能启动初始免疫应答,亦能调控免疫反应强弱,具有重要的免疫调节功能。DC-SIGN是DC表面II型跨膜受体,属于C型凝集素受体超家族成员,由糖识别域(Carbohydrate Recognition Domain,CRD)、颈区、跨膜区和胞浆区等4个结构域组成。CRD参与识别并结合细胞或病原体表面的糖基包括：岩藻糖、Lewis糖、甘露糖等；胞浆区主要参与抗原的内吞。DC-SIGN可与T细胞表面细胞间黏附分子3(intercellular adhesion molecule3,ICAM-3)结合,参与初始T细胞的活化；亦能与血管内皮细胞上的细胞间黏附分子2(intercellular adhesion molecule2,ICAM-2)结合,介导DC的粘附与迁移。最近报道人体液(例如：血清、关节滑液和支气管肺泡灌洗液等)中存在sDC-SIGN,且在炎症刺激下其浓度显著升高,研究发现sDC-SIGN可促进CMV感染DC。鉴于膜型DC-SIGN在启动获得性免疫应答和病原体感染中的关键作用,推测sDC-SIGN亦具有重要的生物学意义。2001年Mummidi等发现短截sDC-SIGN mRNA,但置于CHO细胞中不表达sDC-SIGN。课题组在前期工作中构建了DC-SIGN胞外段(aa61～aa404,含颈区和CRD区)原核表达载体,获得了DC-SIGN的胞外段蛋白并制备了两株单克隆抗体(4H3、1C6)。在本次研究中,我们通过制备抗DC-SIGN胞外段蛋白的多克隆抗体同时表达无融合标签的DC-SIGN胞外段蛋白,建立sDC-SIGN单多抗双夹心 ELISA检测体系,通过比较健康人群和病毒感染及肿瘤患者血清中sDC-SIGN差异探索DC-SIGN的病理生理学意义,为后续研究奠定基础。第一章融合蛋白sDC-SIGN-GST的表达及其多克隆抗体的制备本课题组前期工作将重组质粒PET41a-sDC-SIGN转化至大肠杆菌BL21并进行表达,经抗GST柱纯化已得到融合蛋白sDC-SIGN-GST。为了得到其多克隆抗体,利用该融合蛋白免疫两只2kg左右的雌性家兔(同时设立对照),家兔经三次背部皮下多点免疫,两次静脉加强免疫后,行耳缘静脉取血1～3ml,对抗血清行间接ELISA检测两只家兔的抗血清效价均在1×106以上。此时,对家兔行颈动脉放血,4℃静置保存并于次日离心获得约150ml抗血清。选用饱和硫酸铵法对抗血清进行粗提,纯化后的多克隆抗体经蛋白定量后经SDS-PAGE和Western bolt凝胶电泳分析,证实多克隆抗体可以和融合蛋白sDC-SIGN-GST特异性结合。实验利用融合蛋白sDC-SIGN-GST,免疫家兔成功得到效价高特异性好的抗血清,为后续双夹心ELISA检测体系的建立做好准备。第二章PET17b-sDC-SIGN重组质粒的构建及其蛋白表达由于以PET41a为载体表达出的融和蛋白sDC-SIGN-GST含有较大的GST标签蛋白,为了使后续对蛋白sDC-SIGN生物活性的研究更具说服力,实验中以PET17b为载体重新构建重组质粒PET17b-sDC-SIGN,并转化至大肠杆菌进行表达,以获得不含标签蛋白的sDC-SIGN蛋白。以重组质粒PET41a-sDC-SIGN为模板,PCR扩增获得sDC-SIGN目的基因,分别对产物及载体PET17b用BamHI、EcoRI酶切后连接,未能成功,于是将PCR产物先连接至pMD18T载体上,得到重组质粒PMD18T-sDC-SIGN,进行PCR、双酶切以及测序鉴定所插入目的基因正确后,分别对其和PET17b经BamHI、EcoRI双酶切后连接,获得重组质粒PET17b-sDC-SIGN。PET17b载体上含有强启动子T7,故采用IPTG诱导表达外源蛋白。将PET17b-sDC-SIGN重组质粒转化至大肠杆菌克隆菌,挑取阳性克隆,并在大肠杆菌表达菌体中扩增,当菌量A600达到0.6-1.0时加入1mM IPTG诱导表达sDC-SIGN蛋白,希望得到可溶性表达,这样既可以省去复杂的蛋白变性和复性,重要的是蛋白如能以可溶性形式表达,其结构及活性会更接近于天然蛋白。但sDC-SIGN仍主要以包涵体形式存在。对所制备的sDC-SIGN蛋白经Western blot鉴定：分子质量在38000,且可以与本室制备的抗人DC-SIGN mAb4H3以及商品化的抗DC-SIGN mAb (DCN46)特异性结合,证明该蛋白即我们所需的目的蛋白sDC-SIGN。采用间接ELISA方法检测所表达蛋白sDC-SIGN的免疫原性：包被sDC-SIGN蛋白,检测抗体为4H3,酶标二抗为HRP-抗小鼠IgG。然sDC-SIGN蛋白与单抗结合较弱,但实验中表达了不含标签蛋白的sDC-SIGN蛋白,为深入研究sDC-SIGN的活性及功能奠定了基础。第三章sDC-SIGN单多抗双夹心ELISA检测体系的建立及初步应用使用商品化来源于人体肾脏上皮细胞HEK293表达出的人N端胞外段DC-SIGN(Lys62-Ala404)蛋白作为夹心ELISA体系的标准品。交叉配对选用合适的抗体对,方案如下：1.两株单克隆抗体(4H3、1C6)和一株多克隆抗体,互为捕获抗体和检测抗体；2.多克隆抗体作为捕获抗体,单抗4H3、1C6以及辣根过氧化酶和生物素标记的两株单克隆抗体作为检测抗体。从14种配对方法中挑选灵敏度最高的一组。两株抗sDC-SIGN单克隆抗体与纯化兔抗sDC-SIGN多克隆抗体进行组合,确定以单克隆抗体4H3作为包被抗体,多克隆抗体作为检测抗体,相比较于其他组合可以获得更好的灵敏度。单多抗双夹心ELISA检测体系确立后,我们进一步通过对体系中包被抗体浓度、检测抗体浓度、封闭液及样品稀释液等条件予以优化。最终选用封闭液为5%的脱脂奶粉,采用PBS-1%Tween+1%BSA作为单多抗双夹心ELISA检测体系的缓冲体系,以较少体系非特异性而降低本底值。同时对体系的灵敏度、特异性、检测限及批间批内稳定性进行检测。结果表明：3个OD450点所代表的浓度值的变异系数均小于15%,表明标准曲线可重复性较好。体系批内平均变异系数6.8%,批间平均变异系数7.9%,均小于10%,说明本检测体系的可重复性较好。可以与制备的mAb4H3以及商品化DC-SIGN mAb(DNC46)结合。其体系的检测灵敏度约为5ng/ml,检测范围5-100ng/ml。应用该体系检测人可溶性DC-SIGN在健康人群、大三阳、肠癌、慢性乙型肝炎患者血清中含量,并对其分别进行两独立样本率的χ2检验,统计数据显示：慢性乙型肝炎感染者与健康人群血清中sDC-SIGN含量无统计学差异(P=0.492>0.05)；与大三阳P=0.001<0.05；与肠癌患者P=0.006<0.05。大三阳和肠癌患者血清中sDC-SIGN与健康人有显著差异,或可提示：sDC-SIGN在疾病发生发展中存在一定的意义。

全文目录

摘要  3-7
ABSTRACT  7-15
前言  15-22
第一章利用融合蛋白sDC-SIGN-GST制备多克隆抗体  22-34
  1.1 材料和方法  22-28
  1.2 实验结果  28-30
  1.3 讨论  30-34
第二章 PET17b-sDC-SIGN重组质粒的构建及其蛋白表达  34-47
  2.1 材料和方法  34-41
  2.2 结果  41-45
  2.3 讨论  45-47
第三章 sDC-SIGN单多抗双夹心 ELISA检测体系的建立及初步应用  47-62
  3.1 材料与方法  47-52
  3.2 实验结果  52-57
  3.3 讨论  57-62
全文总结  62-63
参考文献  63-69
中英文缩略词  69-70
在读期间发表的文章  70-71
致谢  71-72

人可溶性DC-SIGN单多抗双夹心ELISA检测体系的建立和初步应用

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