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小鼠肥大细胞蛋白酶4、6的原核表达和多克隆抗体制备

作　者: 刘璐
导　师: 刘健
学　校: 合肥工业大学
专　业: 食品科学
关键词: 小鼠肥大细胞蛋白酶4(mMCP4) 小鼠肥大细胞蛋白酶6(mMCP6) 原核表达 抗体制备
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


在肥胖、糖尿病、粥样动脉硬化和腹主动脉瘤等代谢疾病发病机制中，肥大细胞起着重要的作用。小鼠肥大细胞蛋白酶4、6（mMCP4、mMCP6）是小鼠肥大细胞特异蛋白酶，在肥大细胞相关疾病生物学中具有关键的调控作用。但是，市场上并没有较好的商品化抗体，在一定程度上限制了这些肥大细胞蛋白酶细节作用机制的研究。因此，原核表达并制备这些蛋白酶的抗体，将有利于深入探讨肥大细胞的相关作用机制。本研究，构建了小鼠肥大细胞蛋白酶4(mMCP4)和6(mMCP6)的原核表达体系，诱导表达并纯化了包涵体蛋白，并通过多次皮下注射制备了兔抗mMCP4和兔抗mMCP6多克隆抗体。其具体方法包括：(1)提取小鼠脾细胞总RNA，运用RT-PCR技术获得目的基因mMCP4、 mMCP6；(2)构建重组原核表达载体pET28a-mMCP4、pET28a-mMCP6，将其转化到大肠杆菌BL21中，以异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导融合蛋白表达；(3)利用Ni亲和层析柱纯化mMCP4、mMCP6融合蛋白；(4)纯化后重组蛋白作为抗原免疫兔子获得mMCP4多克隆抗体、mMCP6多克隆抗体；(5)采用ELISA法测抗体效价，western blot测抗体特异性。其具体结果表明：(1)经测序验证，所扩增目的基因mMCP4、mMCP6序列准确，所构建重组表达质粒pET28a-mMCP4、 pET28a-mMCP6成功；(2)经SDS-PAGE电泳验证，所诱导并纯化的mMCP4、mMCP6融合包涵体蛋白分子量符合预期，条带单一；(3)经ELISA测定，所得兔抗mMCP4血清和兔抗mMCP6血清效价分别达到1:128000和1:32000；(4)经western blot和免疫组化分析，表明mMCP4、mMCP6多克隆抗体具有较好的特异性。总之，通过克隆、原核表达和多次免疫，我们成功地获得两种具有良好的效价和特异性的抗体，可用于免疫学检测法，能满足利用之进一步研究肥大细胞的生物学功能的要求。

全文目录


摘要  5-6
ABSTRACT  6-8
致谢  8-14
第一章 绪论  14-25
  1.1 肥大细胞相关代谢疾病的研究背景  14-16
    1.1.1 肥胖相关代谢疾病  15
    1.1.2 肥大细胞与肥胖  15-16
    1.1.3 相关功能食品对肥胖的作用  16
  1.2 类糜蛋白酶和类胰蛋白酶简介  16-18
    1.2.1 类糜蛋白酶简介  16
    1.2.2 类胰蛋白酶简介  16-17
    1.2.3 类胰蛋白酶的生物学效应  17-18
  1.3 类糜蛋白酶和类胰蛋白酶相关疾病  18-23
    1.3.1 类胰蛋白酶的研究进展  19-20
    1.3.2 类糜蛋白酶和类胰蛋白酶在哮喘中的作用  20-21
    1.3.3 类糜蛋白酶与组织纤维化  21
    1.3.4 类糜蛋白酶和类胰蛋白酶在心血管疾病中的作用  21-22
    1.3.5 类糜蛋白酶和类胰蛋白酶与肿瘤的关系  22
    1.3.6 类胰蛋白酶与皮肤炎症  22
    1.3.7 类胰蛋白酶与关节炎症  22-23
    1.3.8 类胰蛋白酶与其他疾病  23
  1.4 小鼠肥大细胞蛋白酶研究背景  23-25
    1.4.1 mMCP4 的研究背景  23-24
    1.4.2 mMCP6 的研究背景  24-25
第二章 小鼠肥大细胞蛋白酶 4 的原核表达  25-36
  2.1 材料与方法  25-32
    2.1.1 主要试剂  25
    2.1.2 主要仪器  25-26
    2.1.3 菌株和载体  26
    2.1.4 实验动物  26
    2.1.5 实验方法  26-32
  2.2 结果与分析  32-35
    2.2.1 RT-PCR 扩增 mMCP4  32-33
    2.2.2 重组原核表达载体 pET28a-mMCP4 的构建  33
    2.2.3 SDS-PAGE 检测重组蛋白 mMCP4 在大肠杆菌 BL21 中的表达  33-34
    2.2.4 融合蛋白 mMCP4 的纯化  34-35
  2.3 讨论  35-36
第三章 兔抗 mMCP4 多克隆抗体的制备  36-43
  3.1 材料与方法  36-40
    3.1.1 主要试剂  36
    3.1.2 主要仪器  36-37
    3.1.3 实验动物  37
    3.1.4 实验方法  37-40
  3.2 结果与分析  40-41
    3.2.1 ELISA 法检测抗血清效价  40
    3.2.2 western blot 检测  40-41
    3.2.3 免疫组化  41
  3.3 讨论  41-43
第四章 小鼠肥大细胞蛋白酶 6 的原核表达  43-49
  4.1 材料与方法  43-46
    4.1.1 主要试剂  43
    4.1.2 主要仪器  43
    4.1.3 菌株和载体  43
    4.1.4 实验动物  43
    4.1.5 实验方法  43-46
  4.2 结果与分析  46-48
    4.2.1 RT-PCR 扩增目的基因  46
    4.2.2 pET28a-mMCP6 表达载体的构建  46-47
    4.2.3 SDS-PAGE 检测重组蛋白 mMCP6 在大肠杆菌 BL21 中的表达  47
    4.2.4 融合蛋白 mMCP6 的纯化  47-48
  4.3 讨论  48-49
第五章 兔抗 mMCP6 多克隆抗体的制备  49-52
  5.1 材料与方法  49
    5.1.1 主要试剂  49
    5.1.2 主要仪器  49
    5.1.3 实验动物  49
    5.1.4 实验方法  49
  5.2 结果与分析  49-51
    5.2.1 ELISA 法检测抗血清效价  49-50
    5.2.2 western blot 检测  50
    5.2.3 免疫组化  50-51
  5.3 讨论  51-52
第六章 展望  52-53
参考文献  53-60
硕士期间发表的论文  60-61

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学免疫学
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