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耐药性嗜麦芽窄食单胞菌和绿脓杆菌噬菌体初步应用研究

作　者: 范华昊
导　师: 童贻刚
学　校: 中南大学
专　业: 生物学
关键词: 嗜麦芽窄食单胞菌铜绿假单胞杆菌细菌耐药性噬菌体生物学特性全基因组测序噬菌体治疗
分类号: R378
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

目的：嗜麦芽窄食单胞菌是一种常见的条件致病菌,由于其能定殖在呼吸道上皮细胞和医疗设备表面使其很容易感染免疫力低下患者,嗜麦芽窄食单胞菌所导致的感染以呼吸道感染最为常见。铜绿假单胞杆菌也是临床上最常见的条件致病菌之一,两类细菌对多类抗生素具有固有耐药性,它们的院内感染对人类健康特别是免疫力低下患者造成重大威胁。本研究就目前嗜麦芽窄食单胞菌和铜绿假单胞杆菌的严重耐药性现状,分别利用临床分离的多重耐药嗜麦芽窄食单胞菌SMA2和铜绿假单胞杆菌Pa44,从医院污水中分离到可裂解SMA2的噬菌体IME13、IME15以及Pa44的噬菌体Pa27P1,分析它们的生物学特性,并构建SMA2免疫抑制Balb/c小鼠肺部感染治疗模型、Pa44腹腔感染小鼠模型及其治疗模型。方法：以临床分离的耐药性嗜麦芽窄食单胞菌SMA2和铜绿假单胞杆菌Pa44为指示菌,利用噬斑法从医院污水中分离噬菌体；利用双层平板培养法测定噬菌体效价、最佳感染复数及一步生长曲线等生物学特性；蛋白酶K/SDS法提取噬菌体IME13、IME15基因组并用454测序仪测定噬菌体全基因组序列。用滴鼻法给小鼠肺部感染最小致死量的嗜麦芽窄食单胞菌SMA2,感染后分别用嗜麦芽窄食单胞菌噬菌体IME13、IME15经滴鼻方式进行治疗,记录小鼠死亡率和噬菌体的治疗效果。利用腹腔注射的方法建立小鼠的铜绿假单胞杆菌Pa44全身感染模型。应用筛选出的噬菌体Pa27P1分不同时间点和不同治疗剂量经腹腔注射对腹腔感染耐药性铜绿假单胞菌Pa44的Balb/c小鼠进行治疗,观察噬菌体的治疗效果。结果：成功分离出2株嗜麦芽窄食单胞菌噬菌体IME13、IME15,其中IME13具有独特的噬斑形态和多达3100的爆发量,IME15是第一株T7类嗜麦芽窄食单胞菌噬菌体；成功分离出铜绿假单胞杆菌噬菌体近90株,并筛选出5株相对广谱的Pa3P1、Pa4P5、Pa12P1、Pa20P5和Pa28P2,这五株噬菌体的组合在体外能裂解所有18株铜绿假单胞杆菌。动物实验表明噬菌体IME13和IME15对于嗜麦芽窄食单胞菌SMA2导致的肺部感染具有较好的治疗效果,噬菌体Pa27P1对于铜绿假单胞杆菌Pa44导致的全身感染和肺部感染具有较好的治疗效果,在感染后及时进行噬菌体治疗对于降低小鼠死亡率有一定意义。结论：随着嗜麦芽窄食单胞菌和铜绿假单胞杆菌耐药性和对免疫抑制患者的致病性日趋严重,积极探索不依赖抗生素的治疗方法势在必行。研究结果表明利用医院废水分离噬菌体并用于治疗细菌感染性疾病的方法是可行的,有望为细菌感染的抗生素替代疗法奠定基础。图11幅,表4个,参考文献43篇。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-8
目录  8-11
符号说明  11-12
1 绪论  12-18
  1.1 噬菌体及噬菌体治疗  12-14
    1.1.1 噬菌体简介  12-14
    1.1.2 活噬菌体用于细菌性疾病的治疗  14
  1.2 嗜麦芽窄食单胞菌及其耐药现状  14-15
    1.2.1 嗜麦芽窄食单胞菌概述  14-15
    1.2.2 嗜麦芽窄食单胞菌致病性及耐药性现状  15
  1.3 铜绿假单胞杆菌及其耐药现状  15-17
    1.3.1 铜绿假单胞杆菌概述  15-16
    1.3.2 铜绿假单胞杆菌致病性和耐药性  16-17
  1.4 本文研究内容  17-18
2 嗜麦芽窄食单胞菌噬菌体的分离、鉴定与生物学特性研究  18-30
  2.1 材料与方法  18-23
    2.1.1 供试菌株  18
    2.1.2 培养基及试剂  18
    2.1.3 嗜麦芽窄食单胞菌SMA2的16S rRNA种属鉴定  18-19
    2.1.4 PCR产物纯化  19
    2.1.5 嗜麦芽窄食单胞菌SMA2耐药谱鉴定  19
    2.1.6 嗜麦芽窄食单胞菌SMA2噬菌体的分离  19-20
    2.1.7 嗜麦芽窄食单胞菌噬菌体IME13、IME15的生物学特性研究  20-23
    2.1.8 噬菌体IME13、IME15的全基因组测序  23
  2.2 结果  23-28
    2.2.1 嗜麦芽窄食单胞菌SMA2的种属鉴定结果  23-24
    2.2.2 嗜麦芽窄食单胞菌SMA2的耐药谱鉴定结果  24
    2.2.3 嗜麦芽窄食单胞菌SMA2的噬菌体分离结果  24-25
    2.2.4 噬菌体IME13、IME15最佳感染复数的测定结果  25
    2.2.5 IME13和IME15一步生长曲线  25-28
  2.3 讨论  28-30
3 嗜麦芽窄食单胞菌噬菌体治疗肺部感染小鼠模型  30-35
  3.1 引言  30
  3.2 材料与方法  30
    3.2.1 菌株、噬菌体、培养基及试剂  30
    3.2.2 实验动物  30
  3.3 最小致死量的测定  30-31
    3.3.1 菌液制备  30-31
    3.3.2 免疫抑制动物感染实验  31
    3.3.3 感染模型指标评价  31
  3.4 噬菌体IME13、IMEl 5治疗SMA2肺部感染的初步探索  31-32
    3.4.1 菌液制备  31
    3.4.2 免疫抑制动物感染治疗实验  31-32
    3.4.3 治疗模型评价指标  32
  3.5 结果  32-33
    3.5.1 嗜麦芽窄食单胞菌SMA2肺部感染Balb/c小鼠模型的建立  32
    3.5.2 噬菌体治疗效果的初步研究  32-33
  3.6 讨论  33-35
4 绿脓杆菌噬菌体的分离、鉴定与生物学特性研究  35-46
  4.1 材料与方法  35-39
    4.1.1 供试菌株和质粒  35
    4.1.2 培养基及试剂  35
    4.1.3 绿脓杆菌噬菌体的大规模分离  35-36
    4.1.4 铜绿假单胞杆菌Pa44的16S rRNA鉴定  36
    4.1.5 PCR产物纯化  36-37
    4.1.6 铜绿假单胞杆菌Pa44的耐药谱鉴定  37
    4.1.7 噬菌体Pa27P1的生物学特性研究  37-39
  4.2 结果  39-44
    4.2.1 噬菌体的分离及其宿主范围  39-41
    4.2.2 铜绿假单胞杆菌Pa44的16S rRNA鉴定  41-42
    4.2.3 铜绿假单胞杆菌Pa44的耐药谱鉴定  42-43
    4.2.4 噬菌体Pa27P1最佳感染复数的测定结果  43
    4.2.5 噬菌体Pa27P1一步生长曲线  43-44
  4.3 讨论  44-46
5 铜绿假单胞杆菌噬菌体Pa27P1治疗全身感染小鼠模型  46-51
  5.1 材料与方法  46
    5.1.1 菌株、噬菌体、培养基及试剂  46
    5.1.2 实验动物  46
  5.2 最小致死量的测定  46-47
    5.2.1 菌液制备  46
    5.2.2 动物腹腔感染实验  46-47
    5.2.3 腹腔感染模型评价指标  47
  5.3 噬菌体Pa27P1治疗Pa44全身感染的初步探索  47-48
    5.3.1 菌液和噬菌体制备  47
    5.3.2 噬菌体Pa27P1治疗Pa44腹腔感染最佳治疗剂量的研究  47
    5.3.3 噬菌体Pa27P1治疗Pa44腹腔感染最佳治疗时间的研究  47-48
    5.3.4 治疗模型评价指标  48
  5.4 结果  48-49
    5.4.1 铜绿假单胞杆菌Pa44全身感染Balb/c小鼠模型的建立  48
    5.4.2 噬菌体Pa27P1治疗Pa44腹腔感染最佳治疗剂量的研究结果  48-49
    5.4.3 噬菌体Pa27P1治疗Pa44腹腔感染最佳治疗时间的研究结果  49
  5.5 讨论  49-51
参考文献  51-55
综述  55-63
  参考文献  60-63
主要溶液的配制  63-65
主要仪器  65-66
攻读硕士学位期间发表的论文  66-67
致谢  67

耐药性嗜麦芽窄食单胞菌和绿脓杆菌噬菌体初步应用研究

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