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大肠杆菌O157 Stx噬菌体裂解酶的原核表达及活性研究

作　者: 杨曦
导　师: 严亚贤
学　校: 上海交通大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 大肠杆菌O157 噬菌体 裂解酶 酶活性
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


大肠杆菌O157是肠出血性大肠杆菌中(enterohemorrhagic Escherichia coli, EHEC)的一个主要血清型,可引起人的腹泻和出血性肠炎(Hemorrhagic colitis , HC)等,严重的还可导致继发性溶血性尿毒综合征(hemolytic uremic syndrome , HUS)和血栓性血小板减少性紫癜(thrombotic thrombocytopenic purpura, TTP)以及脑炎等并发症,病死率较高。大肠杆菌O157于1982年在美国首次被发现,此后在世界各地呈散发或地方性流行。O157感染具有暴发流行趋势、强烈的致病性与致死性以及抗生素治疗可能会加剧病情等特点,已成为全球关注的公共卫生问题,因此对该菌的防控研究成为当前亟需解决的问题。由噬菌体基因编码的裂解酶——裂解效率高、能够与抗生素协同作用,且不易产生抗药性,是一种非常有应用前景的新型生物杀菌制剂。本文通过重组表达的方法获得纯化的大肠杆菌O157 Stx噬菌体裂解酶并分析了该酶抗菌特征。利用SignalP3.0、NCBI CDD、SWISS-MODEL和MEMSAT3等蛋白结构分析软件对大肠杆菌O157ΦMin27的内溶素(裂解酶)进行分析,表明证实该内溶素蛋白分子含有信号肽区段与裂解酶活性位点。为了进一步研究裂解酶的结构特性和抗菌活性,采用PCR扩增大肠杆菌O157ΦMin27噬菌体的裂解酶基因(R gene)的两个区段,目的片段克隆至大肠杆菌表达载体pET28a,分别获得了含有信号肽和不含信号肽的噬菌体裂解酶重组表达菌。结果显示带信号肽的重组表达菌(BL21/pET28a-LysEC1)具有裂解大肠杆菌O157 Min27和大肠杆菌MC1061的活性;而不带信号的重组表达菌(BL21/pET28a-LysEC2)不具备相应的裂解活性,表明Stx噬菌体裂解酶分泌到细胞外可能需要信号肽的辅助参与。对带有信号肽的重组表达菌进行诱导表达,获得23kDa的融合LysEC1蛋白,表达产物经纯化后,浓度可达1mg/ml。重组蛋白体外生物学活性的研究发现LysEC1可对多种大肠杆菌发挥良好裂解作用。通过浊度递减试验确定了LysEC1的酶活性单位,酶比活为800unit/mg。测定LysEC1的裂解谱,结果显示LysEC1能够裂解大肠杆菌O157 Min27株、大肠杆菌MC1061、大肠杆菌O46和大肠杆菌O115等,未发现LysEC1能够裂解除大肠杆菌外的其它菌株,表明原核表达的纯化LysEC1具有对大肠杆菌特异性裂解的作用,对抗菌治疗具有一定的开发潜力。

全文目录


摘要  3-5
ABSTRACT  5-9
第一章 文献综述  9-19
  1 大肠杆菌O157 的研究概况  10-15
    1.1 病原特征  10-11
    1.2 流行病学  11-12
    1.3 致病机理  12-14
    1.4 治疗与防控  14-15
  2 噬菌体裂解酶的研究进展  15-18
    2.1 噬菌体裂解酶的分类  15-16
    2.2 裂解酶的结构域  16
    2.3 裂解酶的作用机制  16
    2.4 噬菌体裂解酶的作用特点  16-17
    2.5 噬菌体裂解酶的作用效果  17-18
    2.6 发展趋势  18
  3 本文的研究目的及意义  18-19
第二章 大肠杆菌 O157 Stx 噬菌体裂解酶的表达与纯化  19-41
  1 材料与方法  20-29
    1.1 材料  20
    1.2 目的片段的扩增  20-22
    1.3 载体构建和重组菌株的诱导表达  22-24
    1.4 SDS-PAGE 分析  24-25
    1.5 平板试验  25-26
    1.6 裂解酶二级结构和三级结构的生物信息学分析  26
    1.7 含pET28a-LysEC1 质粒的重组菌表达诱导条件的优化  26-27
    1.8 裂解酶的纯化  27-28
    1.9 重组蛋白LysEC1 的Western-blot 分析  28-29
  2 结果  29-39
    2.1 裂解酶蛋白的信号肽结构分析  29-30
    2.2 质粒的构建和测序鉴定  30-31
    2.3 蛋白表达产物  31-32
    2.4 平板裂解试验  32
    2.5 LysEC1 二级结构和三级结构的生物信息学分析  32-34
    2.6 含pET28a-LysEC1 质粒的重组菌表达诱导条件的优化  34-37
    2.7 重组蛋白的纯化  37-38
    2.8 重组蛋白浓度测定  38
    2.9 重组蛋白LysEC1 的Western-blot 分析  38-39
  3 讨论  39-41
第三章: 重组蛋白 LysEC1 的酶活性研究  41-50
  1 材料与方法  42-44
    1.1 菌株和质粒  42
    1.2 主要酶和试剂  42
    1.3 平板裂解实验  42
    1.4 LysEC1 的活性单位  42-43
    1.5 最佳pH 的确定  43
    1.6 最佳温度的确定  43
    1.7 裂解谱和裂解效率的检测  43-44
  2 结果  44-48
    2.1 LysEC1 的平板裂解实验  44-45
    2.2 LysEC1 的活性单位  45
    2.3 LysEC1 最佳pH 的测定  45-46
    2.4 LysEC1 最佳温度的测定  46-47
    2.5 LysEC1 对菌株的裂解谱和裂解效率  47-48
  3 讨论  48-50
第四章 全文总结  50-51
参考文献  51-58
附录1 试剂配制  58-60
攻读硕士学位期间发表论文  60-61
致谢  61-63

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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