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脂肪组织分泌物诱导脂肪干细胞成脂相关研究

作　者: 李婷
导　师: 李勇
学　校: 重庆医科大学
专　业: 口腔临床医学
关键词: 脂肪组织成脂因子成脂分化
分类号: R329
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

临床上因创伤、肿瘤术后、感染及先天缺陷的患者，需要大量的脂肪组织来修复软组织缺损。然而，常用的自体脂肪移植有很多的局限。脂肪组织工程是应用干细胞对软组织进行重建的一门新兴技术，干细胞和成脂因子在其中起着关键的作用。脂肪干细胞由于其来源广泛、含量丰富、取材方便、具有多向方分化潜能，已广泛应用于组织工程研究。脂肪组织不仅仅是能量存储的器官，并且能分泌大量细胞因子。我们在脂肪组织块原代法培养脂肪细胞时发现，脂肪干细胞向脂肪细胞方向分化。脂肪组织分泌物可能含有，能诱导脂肪干细胞脂向分化的成脂因子。现在研究比较成熟的体外成脂诱导因子包括：胰岛素、吲哚美辛等，对生理性成脂因子的研究较少。本课题采用组织块原代培养法获取脂肪干细胞，探索脂肪组织分泌物与成脂间的关系，及脂肪组织分泌物中可能的成脂因子。对生理性成脂因子的研究将为脂肪组织工程应用于临床奠定基础。方法：1、脂肪组织块原代培养法分离培养大鼠脂肪干细胞，采用倒置显微镜观察细胞的形态和生长状况。将原代细胞培养传代，纯化至第四代后，分别用成脂、成骨、成神经化学诱导剂进行诱导培养，然后进行油红O染色、茜素红染色及荧光免疫实验。2、脂肪组织块贴壁法收集前三天培养液作为ATE，对第四代生长状态良好的大鼠脂肪干细胞，进行诱导。而后进行油红O染色实验。3、用含有FBS和无FBS的培养基对脂肪组织块进行培养并收集ATE，分别对大鼠脂肪干细胞进行成脂诱导，进行油红O染色实验。4、收集无FBS培养基获取的ATE，分为100μg/ml、250μg/ml、500μg/ml组分，对第四代大鼠脂肪干细胞进行诱导，分别观察各诱导组成脂情况，进行油红O染色实验、成脂率检测实验，及细胞增殖和迁移实验。5、用超滤管将ATE按分子量富集为5个不同的组分，分别对第四代脂肪干细胞进行诱导，观察。并进行western blot实验，荧光免疫染色实验。6、以脂肪干细胞分泌蛋白作为对照，将脂肪组织分泌物进行质谱分析，通过信息学分析探索ATE中的成脂因子。并用western blot实验验证。结果：1、脂肪组织块法获得的细胞生长状态良好，能向脂肪细胞、成骨细胞及神经细胞系方向分化。2、ATE诱导二天时，可见个别第四代大鼠脂肪干细胞胞浆内有脂滴形成，第七天时，脂滴融合变大。阴性对照组未见脂滴形成。3、获取ATE时添加或不添加FBS，在第七天时ADSCs胞浆中均有成熟脂滴形成，两组成脂率无统计学差别(P>0.05)。4、500μg/ml组分较100μg/ml、250μg/ml组分成脂率高。不同浓度的ATE对大鼠脂肪干细胞的增殖均有抑制作用，但是各组间抑制程度相仿，无统计学意义(P<0.01)。ATE对大鼠脂肪干细胞的迁移没有影响。5、分子量>100KDa组分诱导大鼠脂肪干细胞，可见细胞脂向分化，而其它组未见成脂。western blot，荧光免疫实验结果表明分子量>100KDa诱导组细胞,成脂相关蛋白表达阳性。6、通过质谱分析找出差异表达蛋白中，分子量大于100KDa的蛋白有Col I、CP、IGg2a、FN，western bolt实验再次验证结果的可靠性。结论：1、脂肪组织块法获得的细胞有脂肪干细胞的生物学特性，具有良好的多向分化能力。2、ATE能诱导脂肪干细胞成脂分化。3、FBS对ATE获取的成脂能力无影响。4、浓度较高的500μg/ml组较浓度较低组的成脂能力更强。ATE能够抑制细胞增殖，与干细胞成脂分化机制相符，但这种抑制不是无限制的。ATE对细胞迁移无影响。5、脂肪组织块分泌物中具有成脂分化能力的因子集中在分子量>100KDa组分，为进一步研究新的生理性的成脂因子奠定了基础。6、通过我们的实验证实，Col I、CP、IGg2a、FN的确存在于脂肪组织分泌物中，其表达量及种类与单纯的脂肪干细胞分泌蛋白不同，是可能的成脂因子。

全文目录

英汉缩略语名词对照  6-7
摘要  7-10
ABSTRACT  10-15
前言  15-17
实验一大鼠脂肪干细胞培养及多向分化能力的实验研究  17-24
  1 材料与方法  17-20
  2 结果  20-21
  3 讨论  21-24
实验二脂肪组织分泌物的获取及诱导脂肪干细胞成脂分化能力的研究  24-27
  1 材料与方法  24-25
  2 结果  25
  3 讨论  25-27
实验三 FBS 对获取脂肪组织分泌物诱导脂肪干细胞成脂影响的研究  27-31
  1 材料与方法  27-29
  2 结果  29
  3 讨论  29-31
实验四脂肪组织分泌物蛋白含量浓度对脂肪干细胞成脂影响的研究  31-37
  1 材料与方法  31-33
  2 结果  33-35
  3 讨论  35-37
实验五脂肪组织分泌物中成脂因子分子量范围的研究  37-45
  1 材料与方法  37-41
  2 结果  41-43
  3 讨论  43-45
实验六脂肪组织分泌物中成脂因子的研究  45-52
  1 材料与方法  45-48
  2 结果  48
  3 讨论  48-52
全文总结  52-53
参考文献  53-56
文献综述  56-64
  参考文献  61-64
致谢  64-65
攻读学位期间的研究成果及发表的学术论文目录  65-66

脂肪组织分泌物诱导脂肪干细胞成脂相关研究

内容摘要

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