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高剂量绿原酸及其中药注射剂引微循环障碍的机制研究

作　者: 都文渊
导　师: 李澎涛
学　校: 北京中医药大学
专　业: 中西医结合基础
关键词: 绿原酸 NADPH氧化酶微循环障碍氧化应激炎性损伤中药注射剂
分类号: R285.5
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

研究背景：随着中药注射剂的普遍使用,药物不良反应的发生也随之增加,中药注射剂安全性问题已成为中药现代化发展的巨大障碍。绿原酸作为主要有效成分,在清热解毒类注射剂中普遍存在。其中,临床不良反应发生率排名第一位的双黄连注射剂中含有高剂量的绿原酸。绿原酸作为一种可疑的致敏物质,被认为是含绿原酸的中药注射剂引发不良反应的原因。但是,关于绿原酸是否具有致敏性的问题,学术界尚无定论。目前,对于绿原酸所引起的临床不良反应发生机制仍不清楚。对临床不良反应事件的分析发现,大多案例并没有表现出像青霉素过敏那样经典的变态反应过程,其发生常常隐匿并呈渐进加重过程。而且,可发生于首次用药、数日用药后和大剂量用药的过程中,无规律可循。可见,单纯以过敏反应来概括含绿原酸类中药注射剂临床不良反应原因,具有较大的片面性。从临床上休克等严重不良反应案例来看,出现休克征象时循环已近衰竭,并呈现大循环与微循环分离的现象,发生严重的血流动力障碍。因此,我们大胆地提出假设：绿原酸可能引起以微循环损害为起源的损伤过程,进而导致一系列具有不同临床表现的不良反应的发生。目的：本研究以活体微循环观察技术为主要实验手段,探索不同剂量绿原酸、双黄连注射剂及中药注射剂中其他常见有机酸类成分对大鼠微循环的影响及引发机体损伤的分子机制。方法：6-8周龄,体重200-220g的雄性Wistar大鼠,经左侧颈静脉滴注不同剂量绿原酸双黄连或其他有机酸(咖啡酸、丹酚酸B、阿魏酸)。采用活体动态微循环观测系统,在不同时间点,对给药后大鼠肠系膜微循环的各项指标进行观察,主要指标包括：白细胞黏附、细静脉管径、白蛋白渗出、内皮过氧化产物和肥大细胞脱颗粒率。并于单次或多次给药后的不同时间点,检测相关分子的变化：采用流式细胞术检测外周血白细胞表面黏附分子CDllb/CD18；HE染色检测末段结肠组织形态;ELISA检测血清中炎性因子IL-6、 TNF-α、IL-10及血管活性因子ET-1、iNOS的含量变化；Western blot检测肺、肠、脑组织中NF-κB p65的表达；Real-time PCR和Western blot检测不同组织中NOX亚单位NOX4、p22phox、p47phox mRNA及蛋白表达水平；普通组织化学法检测组织MPO、MDA及血清SOD、CAT的活性。结果：1)静脉滴注高剂量绿原酸后,首先引起微循环血管内皮ROS产生增加,上调NADPH氧化酶NOX4、p22phox和p47pox亚基mRNA及蛋白表达水平。多次给药后,引起抗氧化酶类SOD和CAT活性降低,诱导机体氧化应激状态,引起脂质过氧化产物MDA含量的增加,造成脂质的过氧化损伤。并且,通过增加白细胞表面黏附分子CDllb/CD18的表达引起微循环白细胞黏附聚集,使组织MPO活性增加,促使炎症细胞因子IL-6和TNF-α高表达。最终因氧化应激与炎性损伤的多重作用,导致微循环血管通透性增加,造成微循环障碍,并引起组织充血水肿、大量的炎性细胞浸润及组织结构的破坏。然而,中、低剂量绿原酸不引起上述任何改变,其促氧化性表现出显著的剂量依赖性特点；2)含高剂量绿原酸的双黄连注射剂同样可以引起微循环内皮ROS产生增加,上调不同组织中NOX4和p47phox蛋白表达水平,引起抗氧化酶CAT活性降低。高剂量绿原酸和双黄连均可促使IL-10/TNF-α比率的下降,并上调肺、脑组织中多种炎性因子及细胞因子共同的核转录子NF-κB的表达,破坏机体抗／促炎反应的平衡。双黄连的促氧化作用同样具有剂量依赖性特点；3)高剂量阿魏酸可增加微循环内皮ROS的产生,及上调NOX4蛋白的表达;4)绿原酸、双黄连以及其他有机酸(咖啡酸、丹酚酸B、阿魏酸)均未引起肥大细胞脱颗粒率的改变,不引起肥大细胞的活化。结论：1)绿原酸产生的促氧化作用具有剂量依赖性,高剂量绿原酸引起微循环ROS的产生显著增加,NADPH氧化酶可能是绿原酸诱导的ROS的来源之一；2)绿原酸诱发的氧化应激包括促进ROS的产生与降低抗氧化酶SOD和CAT的活性两个方面,并引起组织脂质过氧化损伤；3)高剂量绿原酸引起内皮细胞过氧化、白细胞黏附增加,微血管通透性增高,导致微循环障碍的发生；并可增加促炎因子IL-6和TNF-α的表达,及引起组织中大量炎性细胞浸润,造成组织结构的破坏,使机体产生炎性损伤；4)双黄连具有与绿原酸相同的促氧化作用及剂量依赖性,可上调NADPH氧化酶的表达,及降低CAT的活性；高剂量绿原酸和双黄连均可上调组织中NF-κB的表达、引起IL-10/TNF-α比率的下降,破坏机体抗／促炎反应的平衡；5)高剂量阿魏酸也可增加内皮ROS的产生,及上调NOX4蛋白的表达,表现出与绿原酸类似的促氧化作用；6)绿原酸引起的微循环障碍及组织损伤,其发生机制与氧化应激及炎性反应有关,不涉及肥大细胞的激活。本研究从绿原酸具有促氧化作用的新角度入手,阐释绿原酸及其中药注射剂引起机体损害的机制,为研究中药制剂临床不良反应的发生机制提供了新的视角。并为含绿原酸的中药注射剂的研制、内控标准的制定及临床安全用药等提供基础数据。

全文目录

目录  3-5
摘要  5-8
Abstract  8-12
文献综述  12-37
  综述一  12-23
    参考文献  17-23
  综述二  23-37
    参考文献  31-37
前言  37-40
实验一不同剂量绿原酸对微循环的影响及相关机制研究  40-70
  材料与方法  41-54
    1 主要材料、试剂与仪器设备  41-44
    2 试剂配制  44-45
    3 实验动物分组与给药  45-47
    4 微循环观察  47-48
    5 流式细胞术检测CD11b/CD18  48
    6 HE染色检测组织形态  48
    7 ELISA检测血清中炎性因子及血管活性因子  48-49
    8 Real-time PCR检测NOX各亚单位mRNA表达  49-50
    9 Western blot检测蛋白表达  50-52
    10 组织化学法检测MPO、MDA、SOD、CAT  52-53
    11 统计学处理  53-54
  结果  54-65
    1 高剂量绿原酸引起微循环血管内皮ROS产生增加  54
    2 高剂量绿原酸上调NOX4、p22phox和p47phox亚基mRNA及蛋白表达水平  54
    3 高剂量绿原酸增加微循环白细胞黏附及白细胞表面黏附分子的表达  54-58
    4 高剂量绿原酸诱导微循环血管通透性增加  58-59
    5 高剂量绿原酸引起抗氧化酶类SOD和CAT活性降低  59
    6 高剂量绿原酸引起脂质过氧化损伤产物MDA增加  59
    7 高剂量绿原酸引起炎症细胞因子IL-6和TNF-α高表达  59
    8 高剂量绿原酸引起组织MPO活性增加和组织形态损伤  59-63
    9 绿原酸对大鼠肥大细胞脱颗粒率无影响  63-65
  讨论  65-70
    1 绿原酸产生的促氧化作用具有剂量依赖性  65-66
    2 NADPH氧化酶可能是绿原酸诱导的ROS的来源之一  66-67
    3 绿原酸诱发氧化应激,引起脂质过氧化并促进炎性损伤的发生  67-68
    4 绿原酸引起的氧化应激与炎性反应促使微循环障碍的发生  68
    5 绿原酸未引起肥大细胞的激活  68-70
实验二含绿原酸的中药注射剂对微循环的影响及相关机制研究  70-89
  材料与方法  71-75
    1 主要材料、试刻与仪器设备  71
    2 试剂配制  71-72
    3 实验动物分组与给药  72-73
    4 微循环观察  73
    5 ELISA检测血清中炎性因子及血管活性因子  73
    6 Western blot检测蛋白表达  73-74
    7 组织化学法检测血清中CAT活力  74
    8 统计学处理  74-75
  结果  75-85
    1 高剂量双黄连引起微循环内皮ROS产生增加  75-76
    2 首次给药后1h内未观察到双黄连对微循环白细胞黏附的影响  76-77
    3 高剂量双黄连上调不同组织中NOX4和p47phox蛋白表达水平  77-80
    4 高剂量双黄连引起抗氧化酶CAT活性降低  80
    5 高剂量绿原酸和双黄连引起抗炎/促炎细胞因子失衡  80-81
    6 高剂量绿原酸和双黄连上调肺组织及脑组织中NF-κB p65表达水平  81-83
    7 未观察到绿原酸及双黄连对微循环管径及血管活性因子的影响  83-84
    8 双黄连注射剂对大鼠肥大细胞脱颗粒率无影响  84-85
  讨论  85-89
    1 双黄连具有与绿原酸相同的促氧化作用及剂量依赖性  85
    2 双黄连导致的损伤过程与绿原酸有相似性  85-86
    3 双黄连未引起肥大细胞的激活  86
    4 氧化应激与炎性损伤的相互促进  86-89
实验三其他有机酸对微循环的影响  89-99
  材料与方法  90-93
    1 主要材料、试剤与仪器设备  90
    2 试剂配制  90
    3 实验动物分组与给药  90-91
    4 微循环观察  91-92
    5 Western blot检测蛋白表达  92
    6 统计学处理  92-93
  结果  93-98
    1 高剂量阿魏酸引起微循环内皮ROS产生增加  93-94
    2 高剂量阿魏酸上调NOX4蛋白表达水平  94-95
    3 首次给药后1h内未观察到备有机酸对微循环白细胞黏附的影响  95-96
    4 几种有机酸对大鼠肥大细胞脱颗粒率均无影响  96-98
  讨论  98-99
结论  99-100
参考文献  100-108
致谢  108-109
个人简历  109

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