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土鳖虫胃仿生酶解物纯化分离及其物质基础研究

作　者: 黄镇林
导　师: 王玉蓉
学　校: 北京中医药大学
专　业: 中药制药学
关键词: 分离抗凝血酶解工艺舒张血管土鳖虫血管内皮活性因子
分类号: R285.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2014年
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内容摘要

目的研究土鳖虫仿生酶解的工艺条件,分离纯化土鳖虫胃酶解物的抗凝活性组分,考察该组分的理化性质及稳定性；通过体外、体内试验,考察土鳖虫多肽F2-2的抗凝血、舒张血管药效以及对血管内皮活性因子水平的调节作用。方法在胃蛋白酶和胰蛋白酶酶解温度已固定的基础上,以凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血酶原时间(APTT)为指标,筛选酶底比和酶解时间主要工艺参数；并以血小板聚集率、血凝-纤溶动态图为指标,对酶解法提取土鳖虫的工艺合理性进行考察；应用葡聚糖凝胶色谱对土鳖虫胃酶解物进行分离,以药效为指标筛选活性组分；以凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血酶原时间(APTT).凝血酶时间(TT)、纤维蛋白原含量(FIB)、血小板聚集率、纤溶图参数为指标,评价F2-2的体内外抗凝血作用；以离体血管环张力与大鼠血浆NO/ET-1、t-PA/PAI含量为指标,评价多肽F2-2是否具有扩张血管及保护内皮细胞的作用。结果：(1)土鳖虫酶解条件为：土鳖虫先用37℃C人工胃液温浴30min,再加入2.0%(酶底比)胃蛋白酶酶解3h,残渣转入45℃C人工肠液加入4%(酶底比)胰蛋白酶酶解2h。(2)土鳖虫胃酶解物经葡聚糖凝胶色谱G50、G25两次分离后所得的组分F2-2抗凝药效最佳；(3)土鳖虫多肽F2-2在体外可延长家兔血浆APTT/PT/TT、降低FIB、降低血小板聚集率、延长凝血启动时间并降低最大凝固程度；在体内可使大鼠PT/APTT延长、FIB含量降低、血小板聚集率与血液最大凝固程度下降,TT则无差异；(4)F2-2在体外可增加大鼠离体血管环张力,在体内可升高血浆PAI含量,而NO、t-PA与ET-1含量变化则无显著性差异。结论：本文确定了仿生酶解法提取土鳖虫的最佳工艺,并从土鳖虫胃蛋白酶酶解物中分离得到抗凝活性组分F2-2；以药效实验证明组分F2-2具有良好的体内外抗凝血作用、体外扩张血管的作用。可为进一步研究土鳖虫发挥药效的物质基础提供参考。

全文目录

目录  3-7
中文摘要  7-8
Abstract  8-10
英文缩略词  10-11
文献综述  11-26
  第一部分土鳖虫的研究进展  11-18
    1 化学成分  11-12
    2 药理作用  12-16
    3 临床应用  16
    4 不良反应  16-18
  第二部分多肽类成分的常用提取分离与分析方法  18-21
    1 提取方法  18
    2 分离方法  18-20
    3 分析方法  20-21
  第三部分血瘀证的形成机制与血瘀证动物模型的复制  21-26
    1 血瘀证的形成机制  21-23
    2 血瘀证模型的复制  23-26
前言  26-28
引言  28-29
第一部分土鳖虫酶解工艺的优化及胃蛋白酶酶解物的纯化  29-48
  第一章土鳖虫酶解工艺的优化  29-39
    1 仪器与试剂  29-30
    2 实验方法  30-31
      2.1 考察指标  30
      2.2 胃蛋白酶酶解工艺参数研究  30
      2.3 胰蛋白酶酶解工艺参数研究  30-31
    3 实验结果  31-36
      3.1 胃蛋白酶酶解条件  31-33
      3.2 胰蛋白酶酶解条件  33-36
      3.3 验证实验  36
    4 仿生酶解法提取工艺药效验证  36-38
      4.1 验证实验指标  36-38
      4.2 结论分析  38
    5 结论与讨论  38-39
  第二章土鳖虫胃蛋白酶酶解物的分离  39-48
    1 仪器与试剂  39
    2 实验方法  39-41
      2.1 考察指标  39-40
      2.2 样品检测方法  40-41
        2.2.1 紫外在线检测法  40
        2.2.2 考马斯亮兰G-250法  40-41
    3 土鳖虫胃蛋白酶酶解物的分离  41-47
      3.1 葡聚糖凝胶G-50柱层析分离  41-44
      3.2 葡聚糖凝胶G-25柱层析分离  44-47
    4 结论与讨论  47-48
第二部分土鳖虫抗凝组分F2-2理化性质鉴定  48-52
  1 仪器与试剂  48
  2 方法与结果  48-52
    2.1 定性鉴别  48-50
      2.1.1 TLC鉴定  48-49
      2.1.2 HPLC图谱鉴别  49-50
      2.1.3 MALDI-TOF-MASS分子量测定  50
    2.2 等电点测定  50-52
第三部分土鳖虫抗凝组分F2-2体内外药效试验  52-60
  第一章土鳖虫抗凝组分F2-2体外PT/APTT、TT、FIB、血小板聚集率与纤溶图参数等药效试验  52-56
    1 仪器与试剂  52
    2 实验方法  52-53
      2.1 供试血浆的制备  52
      2.2 供试样品的制备  52
      2.3 测试指标  52-53
        2.3.1 FIB试验  52-53
        2.3.2 PT试验  53
        2.3.3 APTT试验  53
        2.3.4 TT试验  53
        2.3.5 血小板聚集率试验  53
        2.3.6 血凝-纤溶动态图试验  53
    3 实验结果  53-55
      3.1 FIB含量测定实验结果  53-54
      3.2 PT/APTT实验结果  54
      3.3 TT与血小板聚集率实验结果  54-55
      3.4 纤溶图试验结果  55
    4 结论与讨论  55-56
  第二章土鳖虫抗凝组分F2-2体内PT/APTT、TT、FIB、血小板聚集率与纤溶图参数等药效试验  56-60
    1 仪器与试剂  56
    2 实验方法  56-57
      2.1 模型的制备  56
      2.2 供试血浆的制备  56
      2.3 测试指标  56-57
        2.3.1 PT、APTT、TT、FIB试验  56-57
        2.3.2 血小板聚集率试验  57
        2.3.3 血凝-纤溶动态图试验  57
    3 实验结果  57-59
      3.1 造模结果  57
      3.2 给药后各指标测定结果  57-59
    4 结论与讨论  59-60
第四部分土鳖虫抗凝组分F2-2对大鼠离体腹动脉血管张力的调节作用  60-62
  1 仪器与试剂  60
  2 实验方法  60-61
    2.1 PSS溶液与KPSS溶液的配制  60
    2.2 供试样品的制备  60
    2.3 离体血管环张力的测定  60-61
  3 实验结果  61
  4 结论与讨论  61-62
第五部分土鳖虫抗凝组分F2-2对大鼠血浆NO/ET-1及T-PA/PAI含量的影响  62-66
  1 仪器与试剂  62
  2 实验方法  62
    2.1 模型的制备  62
    2.2 供试血浆的制备  62
    2.3 血浆NO/ET-1、t-PA/PAI含量的测定  62
  3 实验结果  62-65
    3.1 造模结果  62-63
    3.2 给药后大鼠血浆各指标含量变化  63-65
  4 结论与讨论  65-66
第六部分土鳖虫抗凝组分F2-2稳定性实验  66-72
  1 仪器与试剂  66
  2 实验方法  66-67
    2.1 药效变化  66
    2.2 高效液相色谱图变化  66-67
  3 实验结果  67-71
    3.1 药效变化实验结果  67-69
    3.2 高效液相色谱图变化  69-71
  4 结论与讨论  71-72
总结与讨论  72-74
参考文献  74-80
致谢  80-81
个人简历  81

土鳖虫胃仿生酶解物纯化分离及其物质基础研究

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