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探讨TRPV1在炎症中的作用机制及EVO的干预作用

作　者: 孙邈
导　师: 朱明军
学　校: 河南中医学院
专　业: 中医内科学
关键词: 瞬时受体电位香草酸亚型1(TRPV1) 细胞间粘附分子1（ICAM-1）血管细胞粘附分子1（VCAM-1）肿瘤坏死因子α（TNF-α）白介素6（IL-6）单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）吴茱萸碱（Evodiamine）
分类号: R259
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

背景：众所周知，多种心血管疾病是一种以血管内皮细胞功能障碍为特征的慢性炎症反应性疾病，因此，控制炎症的新方法将成为当今治疗心血管疾病有前途的治疗方法之一。目前，研究表明瞬时受体电位香草酸亚型1（TRPVl）受体具有明显抑制炎症反应的功效,但其作用机理尚不明确。中药吴茱萸治疗心血管疾病已有一定历史，多方面的研究结果提示其有效成分吴茱萸碱(Evodiamine)可能为TRPV1受体激动剂。因此，探明TRPV1受体对血管内皮细胞所介导的炎症反应的影响机制及吴茱萸碱的干预机制，将为下一步的深入研究及临床应用奠定良好的基础。目的：本研究在人脐静脉内皮细胞(HUVEC)培养模型上，通过观察TRPV1受体对脂多糖（LPS）诱导内皮细胞产生细胞因子、化学趋化因子、粘附因子及单核细胞与内皮细胞之间相互作用的影响，以及吴茱萸碱通过TRPV1受体对该过程的影响作用，从而阐明TRPV1受体及吴茱萸碱抑制炎症反应的分子生物学机制。方法：1.实验分组：①正常对照组；②溶媒组（终浓度为5%的DMSO）；③LPS刺激组（加入LPS使其终浓度为1μg／ml）；④CAP+LPS组（分别加入TRPV1特异性激动剂Capsincin和LPS使其终浓度分别为10umol／L和1μg／ml，加入Capsincin处理十五分钟后，再加入LPS）；⑤CAPZ+CAP+LPS组（分别加入TRPV1特异性激动剂和拮抗剂Capsazepine、Capsaicin和LPS使其终浓度分别为10umol／L、10umol／L和1μg／ml，加入Capsazepin处理十五分钟后，再加入Capsaicin充分混匀处理十五分钟后，最后加入LPS）。⑥EVO+LPS组（分别加入吴茱萸碱Evodiamine和LPS使其终浓度分别为10umol／L和1μg／ml，加入Evodiamine处理十五分钟后，再加入LPS）；⑦CAPZ+EVO+LPS组（分别加入Capsazepin、Evodiamine和LPS使其终浓度分别为10umol／L、10umol／L和1μg／ml，加入Capsazepin处理十五分钟后，再加入EVO充分混匀处理十五分钟后，最后加入LPS）。2.HUVEC细胞传至3-6代用于实验，根据MTT法绘制细胞生长曲线初筛出用于实验的细胞密度(具体见材料与方法)。3.MTT比色法检测药物对HUVEC的活力测定，筛选出用于实验的药物浓度(具体见材料与方法)。4.ELISA检测TRPV1对经LPS刺激6h后的HUVEC TNF-α、IL-6和MCP-1表达的影响，及吴茱萸碱对TNF-α表达的影响。5.分别用Western-blot、Real-time PCR检测细胞粘附分子(ICAM-1、VCAM-1)的膜表面蛋白表达、mRNA表达。6.Calcein-AM细胞粘附实验检测TRPV1对经LPS刺激的HUVEC与单核细胞THP-1粘附能力的影响。每组实验重复三次。结果：1.MTT法绘制细胞生长曲线经过4天培养，3×104/㎝2的HUVEC生长态势良好，生长曲线平稳。2.TRPV1特异性激动剂及拮抗剂对HUVEC活力的影响与正常对照组相比较，Capsaicin浓度为1μM，3μM和10μM时细胞存活率无明显变化。3.ELISA检测TRPV1对经LPS诱导后HUVEC炎症介质TNF-α、IL-6和MCP-1蛋白浓度的影响，及吴茱萸碱TNF-α表达的影响。经LPS刺激后，相关炎症介质TNF-α，IL-6，MCP-1的蛋白浓度显著升高，激活TRPV1能明显降低这些炎症介质的蛋白浓度，阻断TRPV1降低IL-6的作用受到抑制，但对TNF-α和MCP-1影响不显著；吴茱萸碱可下调TNF-α表达。4.PCR和Western-blot检测TRPV1对LPS诱导的HUVEC粘附分子基因及膜表面蛋白表达的影响经LPS诱导后，HUVEC的ICAM-1和VCAM-1的mRNA及膜表面蛋白表达显著升高，激活TRPV1能明显降低粘附分子的基因和膜蛋白表达水平，阻断TRPV1后此作用受到抑制。5.TRPV1对经LPS处理的HUVEC与经Calcein-AM处理的THP-1之间粘附能力的影响HUVEC经LPS诱导后与THP-1细胞的粘附能力增强，激活TRPV1能明显降低内皮细胞与单核细胞间的粘附，阻断TRPV1后此作用受到抑制。结论：1.在HUVEC细胞培养模型上,TRPV1受体激活后抑制LPS所诱导的细胞因子、趋化因子和粘附因子的产生,并同时抑制其所诱导的单核细胞粘附过程,该结果提示血管内皮细胞表达的TRPV1受体具有重要的抗炎作用。2.在HUVEC细胞培养模型上，吴茱萸碱抑制LPS所诱导的细胞因子的产生，其作用部分被TRPV1受体拮抗剂所阻断，该结果提示吴茱萸碱可能部分通过激活TRPV1受体抑制炎症反应。

全文目录

缩略语表  3-5
摘要  5-8
Abstract  8-11
前言  11-14
材料与方法  14-28
  1 实验材料  14-17
  2 实验方法  17-27
  3 统计学处理  27-28
结果  28-40
  1、利用 MTT 法确定细胞生长曲线  28
  2、辣椒素（Capsaicin）对 HUVEC 存活率的影响  28-31
  3、TRPV1 受体对 LPS 诱导的 HUVEC 细胞炎症介质 TNFα、IL6 和 MCP1 产生的影响，以及吴茱萸碱对 TNFα表达的影响  31-33
  4、TRPV1 受体对 LPS 诱导的 HUVEC 细胞表达粘附分子基因的影响  33-35
  5、TRPV1 受体对 LPS 诱导 HUVEC 细胞表达粘附因子蛋白表达（ICAM1和 VCAM1）的影响  35-38
  6、TRPV1 受体对 LPS 所诱导的 THP1 细胞与 HUVEC 细胞之间粘附作用的影响  38-40
讨论  40-46
  1. TRPVl 的分子结构及生物学作用  40-42
  2. 血管内皮细胞在炎症过程中的作用  42
  3. TNFα、IL6 和 MCP1 在炎症过程中的作用  42-43
  4. 细胞粘附分子在炎症过程中的作用  43
  5. 吴茱萸碱对 TRPV1 在炎症过程中的干预作用  43-44
  6. 本实验的研究讨论  44-46
结论  46-47
致谢  47-48
参考文献  48-52
附录  52-60
  附录 1 文献综述  52-60
    参考文献  57-60
  附录 2 在校期间科研情况和论文著作  60

探讨TRPV1在炎症中的作用机制及EVO的干预作用

内容摘要

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