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拟穴青蟹细胞周期及泛素系统若干基因参与性腺发育的研究

作　者: 韩坤煌
导　师: 王艺磊
学　校: 集美大学
专　业: 水产养殖
关键词: 拟穴青蟹 Cyclin-CDK-CKI UPP 性腺发育组织表达原位杂交
分类号: S917.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

拟穴青蟹是我国东南沿海重要的经济养殖蟹类之一。目前对于青蟹性腺发育调控的分子机制研究较为薄弱。细胞周期及泛素系统相关基因参与性腺发育的研究已在其他物种中多有报道。因而克隆青蟹细胞周期及泛素系统相关基因，并研究其参与性腺发育的作用机制具有重要的理论意义和应用前景。本研究在实验室所构建的青蟹EST文库基础上筛选出细胞周期及泛素系统的相关基因片段，利用SMART RACE技术克隆出其全长cDNA序列，并利用荧光定量PCR技术及原位杂交技术检测这些基因在雌蟹各组织及性腺不同发育阶段中的表达情况。结果如下：1) Sp-cdc2的cDNA全长为1593bp，编码含299个氨基酸的蛋白。荧光定量PCR结果显示，Sp-cdc2在卵巢中的表达水平极显著地高于其他各组织的表达水平（P<0.01）；在性腺发育过程中Sp-cdc2在卵巢各期的表达水平并无显著性差异（P>0.05），而在精巢T2期的表达水平显著高于T1与T3期的表达水平（P<0.05）。2) Sp-cycB全长cDNA序列为1492bp，编码含391个氨基酸的蛋白，Sp-cycB在卵巢中的表达水平极显著地高于其他各个组织（P<0.01），而在肝胰腺中的表达水平次之；Sp-cycB在O6期中的表达水平显著高于前5期及精巢的表达水平（P<0.05），卵巢前5期的表达水平也显著高于T1期的表达水平（P<0.05），而在精巢各发育阶段的表达水平无显著性差异（P>0.05）。3) Sp-cycH全长cDNA序列为1523bp，编码含332个氨基酸的蛋白，Sp-cycH在卵巢中的表达水平极显著高于其他各组织的表达水平（P<0.01），而在肌肉中的表达水平次之。Sp-cycH在卵巢O6期中的表达水平显著高于其他各阶段的性腺（P<0.05），在O5期和T2期中的表达水平也显著高于T1期的表达水平。4) Sp-CKS1B基因全长cDNA序列为722bp，编码含86个氨基酸的蛋白；Sp-CKS1B在卵巢中的表达水平极显著地高于其他各组织（P<0.01），而在血液、胃和眼睛中的表达水平次之；Sp-CKS1B在T1期中的表达水平最高，并显著高于卵巢前5期和T3期，其次为O6期和T2期。5) Sp-Ub全长cDNA序列为555bp，编码含154个氨基酸的蛋白；Sp-Ub在鳃中的表达水平最高，卵巢次之，各组织间的表达水平无显著性差异，提示Sp-Ub基因在各组织中的表达恒定，具普遍作用；性腺表达结果显示Sp-Ub在O6期的表达水平最高，其次为T2期，且二者的表达水平都与O2、O4、T3期具有显著差异（P<0.05），其他各期之间的差异并不显著。6) Sp-uce2的全长cDNA序列为971bp，编码含160个氨基酸的蛋白；Sp-uce2在卵巢中的表达水平显著高于其他各组织（P<0.05），而在胃和心脏中的表达水平次之；性腺表达结果显示Sp-uce2在T2期的表达水平著高于其他各期的性腺（P<0.05），其次为O5期，O5期的表达水平也显著高于其他各期的性腺（P<0.05）。7) Sp-UCHL3全长cDNA序列为1804bp，编码含228个氨基酸的蛋白。Sp-UCHL3在卵巢中的表达水平极显著高于其他各组织（P<0.01）；Sp-UCHL3基因在O6期的表达水平最高，其次为O1，T3期，而在T2期最低，在O1和O6期的表达水平均显著高于O3、O4、O5、T1和T2(P<0.05），T3则显著高于O4、T1与T2期(P<0.05）。8) Sp-UCHL5全长cDNA序列1217bp，编码含337个氨基酸的蛋白，Sp-UCHL5在卵巢中的表达水平极显著地高于其他各组织（P<0.01），而在眼睛中的表达水平次之；Sp-UCHL5在O6期的表达水平最高，其次为O3期，二者中的表达水平均极显著高于O4, T1、T2、T3期的性腺，而在精巢3期的表达水平无显著性差异（P>0.05）。9)原位杂交结果显示Sp-cdc2和Sp-cycB mRNA在精卵巢不同发育阶段中的分布具有相似性。在精子发生过程中Sp-cdc2和Sp-cycB mRNA在精子细胞中大量表达，而在精原细胞中没有发现杂交信号；在卵子发生过程中Sp-cdc2和Sp-cycB mRNA分布于滤泡细胞，而在卵母细胞中没有发现杂交信号。暗示了Sp-cdc2与Sp-cycB转录本在精子发生和卵子发生过程中可能具有相同的表达模式。总之，这些研究成果为阐明细胞周期及泛素系统相关基因在拟穴青蟹精巢和卵巢发育过程中发挥的作用奠定了基础。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-12
主要符号表  12-13
第1章引言  13-22
  1.1 拟穴青蟹的生物学特性  13
  1.2 虾蟹类参与性腺发育分子机制的研究进展  13-14
  1.3 Cyclin-CDK-CKI 的作用研究  14-16
    1.3.1 Cyclin-CDK-CKI 的组成  14-16
    1.3.2 Cyclin-CDK-CKI 参与生殖过程的研究  16
  1.4 UPP 的组成与生理生化特性及其参与生殖调控的研究  16-19
    1.4.1 UPP 的组成及特性  16-18
    1.4.2 UPP 参与生殖调控的研究  18-19
  1.5 Cyclin-CDK-CKI 与 UPP 之间的联系  19
  1.6 Cyclin-CDK-CKI 与 UPP 系统在虾蟹类性腺发育中的研究进展  19-20
  1.7 本研究的目的意义  20
  1.8 本研究的主要技术路线  20-22
第2章材料与方法  22-29
  2.1 材料  22-23
    2.1.1 拟穴青蟹  22
    2.1.2 主要试剂盒及仪器  22
    2.1.3 引物  22-23
  2.2 方法  23-29
    2.2.1 总 RNA 的提取  23
    2.2.2 EST 序列分析获取目的基因片段  23
    2.2.3 SMART-RACE 技术克隆目的基因全长  23-24
    2.2.4 割胶纯化目的基因片段  24
    2.2.5 与载体连接  24
    2.2.6 转化  24-25
    2.2.7 单克隆检测  25
    2.2.8 利用生物信息学软件分析目的基因的结构与功能预测  25
    2.2.9 Real-time PCR 检测相关基因在性腺不同时相及不同组织中的表达模式  25-26
    2.2.10 原位杂交技术检测细胞周期相关基因在生殖细胞中的表达与定位  26-29
第3章 CYCLIN-CDK-CKI 及 UPP 系统相关基因的克隆与序列分析  29-68
  3.1 总 RNA 的提取  29
  3.2 Sp-cdc2 基因序列分析  29-34
    3.2.1 Sp-cdc2 全长 cDNA 序列分析  29-30
    3.2.2 Sp-cdc2 二级结构和空间模拟结构预测  30-31
    3.2.3 Sp-cdc2 与其他物种 cdc2 的比较分析  31-34
  3.3 Sp-cycB 基因序列分析  34-41
    3.3.1 Sp-cycB 全长 cDNA 序列分析  34-35
    3.3.2 Sp-cycB 蛋白二级结构预测与空间结构模拟  35-37
    3.3.3 Sp-cycB 与其他物种的多重比对及构建的系统进化树  37-41
  3.4 Sp-cycH 基因序列分析  41-46
    3.4.1 Sp-cycH 全长 cDNA 序列分析  41-42
    3.4.2 Sp-cycH 的二级结构和空间模拟结构预测  42-44
    3.4.3 Sp-cycH 与其他物种 cyclin H 的比较分析  44-46
  3.5 Sp-CKS1B 基因序列分析  46-49
    3.5.1 Sp-CKS1B 的全长 cDNA 序列分析  46-47
    3.5.2 Sp-CKS1B 二级结构与空间结构模拟  47-48
    3.5.3 Sp-CKS1B 与其他物种相比较  48-49
  3.6 Sp-Ub 基因序列分析  49-53
    3.6.1 Sp-Ub 全长 cDNA 序列分析  49-50
    3.6.2 Sp-Ub 二级结构和空间模拟结构预测  50-51
    3.6.3 Sp-Ub 与其他物种的 Ub 相比较  51-53
  3.7 Sp-uce2 基因序列分析  53-57
    3.7.1 Sp-uce2 全长 cDNA 序列分析  53-54
    3.7.2 Sp-uce2 二级结构与空间模拟结构预测  54-55
    3.7.3 Sp-uce2 与其他物种 uce2 蛋白相比较  55-57
  3.8 Sp-UCHL3 基因序列分析  57-62
    3.8.1 Sp-UCHL3 的全长 cDNA 序列分析  57-58
    3.8.2 Sp-UCHL3 的二级结构与空间模拟结构预测  58-59
    3.8.3 Sp-UCHL3 与其他物种的 UCHL3 的氨基酸相比较  59-62
  3.9 Sp-UCHL5 基因的序列分析  62-68
    3.9.1 Sp-UCHL5 全长 cDNA 序列分析  62-63
    3.9.2 Sp-UCHL5 的二级结构及空间模拟结构预测  63-65
    3.9.3 Sp-UCHL5 与其他物种的 UCHL5 的氨基酸比较  65-68
第4章 CDK-CYCLIN-CKI 及 UPP 系统相关基因的表达特征  68-82
  4.1 半定量 PCR 技术检测各基因在不同组织间的表达  68
  4.2 荧光定量 PCR 技术检测各基因在不同组织间的表达差异  68-72
    4.2.1 Sp-cdc2 基因在雌蟹个体中不同组织间的表达差异  68-69
    4.2.2 Sp-cycB 基因在雌蟹个体不同组织间的表达差异  69
    4.2.3 Sp-cycH 基因在雌蟹个体不同组织间的表达差异  69-70
    4.2.4 Sp-CKS1B 基因在雌蟹个体不同组织间的表达差异  70
    4.2.5 Sp-Ub 基因在雌蟹个体不同组织间的表达差异  70-71
    4.2.6 Sp-uce2 基因在雌蟹个体不同组织间的表达差异  71
    4.2.7 Sp-UCHL3 基因在雌蟹个体不同组织间的表达差异  71-72
    4.2.8 Sp-UCHL5 基因在雌蟹个体不同组织间的表达差异  72
  4.3 各个基因在性腺不同发育时期的表达  72-77
    4.3.1 Sp-cdc2 基因在各个不同时相中的表达分析  72-73
    4.3.2 Sp-cycB 基因在各个不同时相中的表达分析  73
    4.3.3 Sp-cycH 基因在各个不同时相中的表达分析  73-74
    4.3.4 Sp-CKS1B 基因在各个不同时相中的表达分析  74-75
    4.3.5 Sp-Ub 基因在各个不同时相中的表达分析  75
    4.3.6 Sp-uce2 基因在各个不同时相中的表达分析  75-76
    4.3.7 Sp-UCHL3 基因在各个不同时相中的表达分析  76
    4.3.8 Sp-UCHL5 基因在各个不同时相中的表达分析  76-77
  4.4 Sp-cdc2 与 Sp-cycB 在性腺中的定位表达研究  77-82
    4.4.1 Sp-cdc2 与 Sp-cycB 在精巢中的定位研究  77-78
    4.4.2 Sp-cycB 在卵巢 GSI 为 0.177 时的定位研究  78-79
    4.4.3 Sp-cdc2 与 Sp-cycB 在卵巢 GSI 为 1.650 时的定位表达  79-80
    4.4.4 Sp-cdc2 与 Sp-cycB 在卵巢 GSI 为 4.575 时的定位表达  80-81
    4.4.5 Sp-cdc2 在卵巢 GSI 为 10.912 时的定位表达  81-82
第5章讨论  82-93
  5.1 Cyclin-CDK-CKI 系统  82-88
    5.1.1 Sp-cdc2 和 Sp-cycB 基因  82-86
    5.1.2 Sp-cycH 基因  86-87
    5.1.3 Sp-CKS1B 基因  87-88
  5.2 UPP 系统  88-90
    5.2.1 Sp-Ub 和 Sp-uce2 基因  88-89
    5.2.2 Sp-UCHL3 和 Sp-UCHL5 基因  89-90
  5.3 Cyclin-CDK-CKI 和 UPP 系统之间的关系  90-93
第6章结论和展望  93-95
  6.1 结论  93-94
  6.2 展望  94-95
致谢  95-96
参考文献  96-102
在学期间发表的学术论文和研究成果  102

拟穴青蟹细胞周期及泛素系统若干基因参与性腺发育的研究

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