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家蚕表达人促红细胞生成素（rhEPO）口服药物的研究

作　者: 李杰
导　师: 张耀洲
学　校: 浙江理工大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 家蚕 BmrhEPO 口服肾性贫血
分类号: S884
类　型: 硕士论文
年　份: 2014年
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内容摘要

为了研究家蚕表达的重组人促红细胞生成素（rhEPO）口服治疗肾性贫血的疗效并评价安全性，本论文使用Bac-to-Bac系统构建重组人促红细胞生成素家蚕杆状病毒（vBm-rhEPO），并使用实时荧光定量PCR的方法检测重组病毒滴度。经SDS-PAGE和Western Blotting鉴定，家蚕卵巢上皮细胞（BmN cell）、五龄幼虫和蛹分别接种重组病毒vBm-rhEPO发病后，均成功表达rhEPO（BmrhEPO）蛋白，且分子量大小一致，约为25kDa。将接种vBm-rhEPO后发病的蚕蛹匀浆、冻干制成BmrhEPO蚕蛹冻干粉，经ELISA检测，BmrhEPO蚕蛹冻干粉中BmrhEPO蛋白的含量约为8382IU/g。通过分析BmrhEPO对人红系白血病细胞（TF-1cell）生长增殖的促进作用，使用MTT法检测到BmrhEPO具有与rhEPO(中国仓鼠卵巢细胞(CHOcell)表达)相似的体外生物学活性，相同浓度条件下，BmrhEPO的体外生物学活性高于rhEPO（CHO cell），计算得出，BmrhEPO的半数有效浓度EC50值为0.36IU/mL，略低于rhEPO（CHOcell）的EC50值0.39IU/mL。小鼠口服BmrhEPO蚕蛹冻干粉急性毒性实验显示，BmrhEPO蚕蛹冻干粉基本无毒，最大耐受剂量大于147882IU/kg。使用腺嘌呤连续灌胃构建小鼠肾性贫血模型，并通过肾功能和血常规检测鉴定肾性贫血模型是否构建成功。肾性贫血小鼠分别以73958.8、24652.9和14791.8IU/kg三个不同剂量（BmrhEPO蛋白的有效剂量）连续口服BmrhEPO蚕蛹粉，以血液网织红细胞数及百分率作为药效指标，结果显示，三组小鼠的血液网织红细胞数及百分率与阴性对照组相比均有明显升高，并且与口服剂量呈正相关，这表明口服BmrhEPO治疗小鼠肾性贫血有效。本研究为开发重组人促红细胞生成素口服药物提供了实验依据。

全文目录

摘要  5-6
Abstract  6-8
缩略语  8-9
目录  9-13
第一章引言  13-18
  1 EPO 的研究进展  13-15
    1.1 EPO 的历史  13
    1.2 EPO 的生理学  13-14
    1.3 EPO 的分子生物学和细胞生物学  14
    1.4 EPO 的临床应用  14
    1.5 药物研发最新进展  14-15
    1.6 EPO 的表达  15
  2 家蚕杆状病毒表达系统的研究进展  15-16
  3 多肽和蛋白质药物口服给药研究进展  16-18
第二章实验方案设计  18-20
  1 实验目的和意义  18
  2 研究内容  18-19
  3 实验设计路线图  19-20
第三章重组人 EPO 家蚕杆状病毒的构建及鉴定  20-34
  1 材料、试剂与仪器  20
    1.1 材料  20
    1.2 试剂  20
    1.3 仪器  20
    1.4 主要溶液的配制  20
  2 方法  20-29
    2.1 pFast BacⅠ-hEPO 重组载体的构建  20-24
    2.2 重组 Bacmid-hEPO 的构建及鉴定  24-27
    2.3 家蚕卵巢上皮细胞 BmN 细胞的复苏、培养与冻存  27-28
    2.4 重组家蚕杆状病毒 vBm-rhEPO 的构建  28-29
  3 结果  29-32
    3.1 hEPO 基因的获得  29
    3.2 重组质粒 pFastBacⅠ-hEPO 的 PCR 和双酶切鉴定结果  29-30
    3.3 重组 Bacmid-hEPO 的 PCR 鉴定结果  30-31
    3.4 重组病毒 vBm-rhEPO 的鉴定  31-32
  4 讨论  32-34
第四章实时荧光定量PCR 测定重组病毒 vBm-rhEPO 的滴度  34-40
  1 材料、试剂与仪器  34
    1.1 材料  34
    1.2 试剂  34
    1.3 仪器  34
    1.4 主要试剂的配制  34
  2 方法  34-36
    2.1 实时荧光定量 PCR 引物的设计  34
    2.2 重组 Bacmid-hEPO 的提取及含量的测定  34-35
    2.3 重组病毒 vBm-rhEPO 基因组的提取  35
    2.4 标准曲线的绘制  35-36
    2.5 重组病毒 vBm-rhEPO 滴度的测定  36
  3 结果  36-39
    3.1 荧光定量 PCR 标准曲线的绘制  36-38
    3.2 重组杆状病毒滴度的测定  38-39
  4 讨论  39-40
第五章 rhEPO 蛋白在家蚕生物反应器中的表达  40-47
  1 材料、试剂和仪器  40
    1.1 材料  40
    1.2 试剂  40
    1.3 仪器  40
    1.4 试剂配制  40
  2 方法  40-43
    2.1 rhEPO 蛋白在家蚕卵巢上皮细胞 BmN 细胞中的表达及鉴定  40-41
    2.2 rhEPO 蛋白在五龄蚕幼虫的血淋巴中的表达及鉴定  41-42
    2.3 rhEPO 蛋白在家蚕的蛹中表达及鉴定  42
    2.4 BmrhEPO 蚕蛹冻干粉的制备及其中 rhEPO 含量的检测  42-43
  3 结果  43-45
    3.1 rhEPO 蛋白在 BmN 细胞中表达的 SDS-PAGE 和 Western Blotting 鉴定  43
    3.2 rhEPO 蛋白在五龄蚕幼虫血淋巴中表达的 SDS-PAGE 和 Western Blotting 鉴定  43-44
    3.3 rhEPO 蛋白在家蚕的蛹中表达的 SDS-PAGE 和 Western Blotting 鉴定  44-45
    3.4 BmrhEPO 蚕蛹冻干粉的制备及其中 rhEPO 含量的检测  45
  4 讨论  45-47
第六章 BmrhEPO 蛋白体外生物学活性检测  47-51
  1 材料、试剂和仪器  47
    1.1 材料  47
    1.2 试剂  47
    1.3 仪器  47
    1.4 主要试剂的配制  47
  2 方法  47-49
    2.1 TF-1 细胞的培养  47-48
    2.2 使用 MTT 法检测 BmrhEPO 蛋白的体外生物学活性  48-49
  3 结果  49-50
    3.1 使用 MTT 法检测 BmrhEPO 蛋白的体外生物学活性  49-50
  4 讨论  50-51
第七章小鼠口服 BmrhEPO 蚕蛹粉急性毒性实验  51-55
  1 材料与动物  51
  2 方法  51
    2.1 口服给药溶液的配制  51
    2.2 小鼠口服 BmrhEPO 蚕蛹粉急性毒性实验  51
  3 结果  51-54
  4 讨论  54-55
第八章小鼠口服 BmrhEPO 蚕蛹粉药效学实验  55-61
  1 材料与试剂  55
    1.1 材料  55
    1.2 试剂  55
  2 方法  55-56
    2.1 小鼠肾性贫血模型的构建  55
    2.2 小鼠口服 BmrhEPO 蚕蛹粉药效学实验  55-56
  3 结果  56-60
    3.1 小鼠肾性贫血模型的鉴定  56-58
    3.2 小鼠口服 BmrhEPO 蚕蛹粉药效学  58-60
  4 讨论  60-61
结论  61-62
参考文献  62-67
致谢  67-68

家蚕表达人促红细胞生成素（rhEPO）口服药物的研究

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