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家蚕核型多角体病毒(BmNPV)lef-12基因的功能分析

作　者: 袁佳
导　师: 童富淡
学　校: 浙江理工大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: BmNPV lef-12 Red重组系统 Bac to Bac系统病毒复制基因转录蛋白翻译
分类号: S884.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2014年
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内容摘要

晚期表达因子12（late expression factor12，LEF-12）是昆虫核型多角体病毒（nuclearpolyhedrosis virus，NPV）基因组中普遍存在的转录调控因子。研究结果表明LEF-12可影响病毒基因的表达，但其在家蚕核型多角体病毒（BmNPV）基因组中的功能还不清楚。为了研究LEF-12的生物学功能，我们通过Red重组技术敲除了BmNPV的lef-12基因，构建了lef-12缺失型病毒lef12-ko-Bacmid，再利用Bac-to-Bac系统将lef-12基因补回到病毒基因组中，构建了补回型病毒lef12-re-Bacmid。然后将野生型病毒wtBacmid、lef12-ko-Bacmid和lef12-re-Bacmid DNA分别转染家蚕BmN细胞，发现三种病毒转染的细胞内均可产生具有感染活性的病毒粒子，但是病毒滴度测定结果显示lef12-ko-Bacmid的病毒产量比wtBacmid下降了3倍左右，而lef12-re-Bacmid基本上恢复到了野生型病毒的水平，表明lef-12基因的缺失可能会延缓病毒的发病时间。此外，我们进一步研究了lef-12基因敲除对病毒基因组的复制和病毒基因转录的影响。结果发现lef-12基因缺失后，BmNPV DNA复制没有受到明显影响，说明lef-12不是病毒基因组复制的必需基因；对病毒早期基因lef-3的转录水平也没有明显变化，但病毒晚期基因vp39和极晚期基因p10的转录水平均明显低于野生型和补回型病毒（p<0.05）。晚期蛋白VP39和极晚期蛋白P10的表达水平也明显低于野生型和补回型重组病毒（p<0.05）。透射电镜检测结果也进一步证实了lef-12基因缺失后，病毒仍能进行正常复制和装配，但与野生型病毒相比，病毒的繁殖量有所下降。上述研究结果表明BmNPV lef-12不是病毒基因组复制的必需基因，但其缺失将导致细胞发病延迟，对病毒晚期和极晚期基因的转录和翻译也具有一定的影响。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-6
缩略语  6-7
目录  7-11
第一章绪论  11-15
  1 杆状病毒的研究进展  11-12
    1.1 杆状病毒的介绍  11
    1.2 杆状病毒基因组的研究进展  11
    1.3 杆状病毒表达系统的简介  11-12
  2 杆状病毒晚期基因表达因子 LEFs 的研究进展  12-14
    2.1 杆状病毒调控基因的研究  12
    2.2 与病毒 DNA 复制相关的 lef 基因  12-13
    2.3 与病毒基因转录相关的 lef 基因  13-14
  3 Red 重组技术的研究进展  14-15
第二章实验方案设计  15-18
  1 研究的目的及意义  15
  2 研究的主要内容  15-17
  3 实验流程图  17-18
第三章 lef-12 的生物信息学分析  18-23
  1 生物信息学工具  18
  2 方法  18
  3 结果  18-22
    3.1 lef-12 基因的序列分析  18-19
    3.2 LEF-12 的疏水性分析  19-20
    3.3 LEF-12 的信号肽分析  20-21
    3.4 LEF-12 的跨膜区分析  21
    3.5 LEF-12 的二级结构预测  21-22
    3.6 LEF-12 氨基酸序列的同源性分析  22
  4 讨论  22-23
第四章家蚕核型多角体病毒 lef-12 缺失型和补回型病毒的构建  23-39
  1 材料与试剂  23-25
    1.1 材料  23
    1.2 试剂  23
    1.3 试剂配置  23-25
  2 方法  25-33
    2.1 制备 pKD46 质粒  25
    2.2 DH10Bac 感受态细胞制备和 pKD46 质粒的转化  25-26
    2.3 制备含 pKD46 质粒的 DH10Bac 菌株感受态  26
    2.4 lef-12 基因打靶线性片段的制备  26-27
    2.5 lef-12 缺失型 Bacmid 的构建  27-29
    2.6 转移载体 pFastBacHTB-lef12 的构建  29-31
    2.7 lef-12 基因补回型 Bacmid 的构建  31-33
  3 结果  33-37
    3.1 lef-12 基因打靶线性化片段的鉴定  33-34
    3.2 lef-12 基因缺失型 Bacmid 的鉴定  34-35
    3.3 重组转移载体 pFastBacHTB-lef12 的双酶切和 PCR 鉴定  35-36
    3.4 lef-12 基因补回型病毒 lef12-re-Bacmid 的鉴定  36-37
  4 讨论  37-39
第五章 lef-12 对 BmNPV 复制的影响  39-48
  1 材料与试剂  39
    1.1 材料  39
    1.2 试剂  39
  2 方法  39-43
    2.1 家蚕细胞的培养、冻存与复苏  39-40
    2.2 病毒 DNA 的提取  40
    2.3 病毒 DNA 转染家蚕 BmN 细胞  40
    2.4 病毒滴度测定  40-41
    2.5 病毒基因组的提取和消化  41
    2.6 荧光定量 PCR 分析  41-43
  3 结果  43-47
    3.1 lef-12 缺失型病毒转染家蚕细胞  43-44
    3.2 lef-12 缺失型病毒的增殖曲线分析  44
    3.3 lef-12 基因缺失对病毒 DNA 复制的 qPCR 分析  44-47
  4 讨论  47-48
第六章 lef-12 对 BmNPV 病毒基因转录的影响  48-57
  1 材料与试剂  48
    1.1 材料  48
    1.2 试剂  48
  2 方法  48-51
    2.1 lef-12 缺失型病毒转染 BmN 细胞  48-49
    2.2 总 RNA 的提取  49
    2.3 荧光定量 PCR 引物的设计  49
    2.4 基因组 DNA 的降解  49-50
    2.5 cDNA 第一链的合成  50
    2.6 荧光定量 PCR  50-51
    2.7 荧光定量 PCR 数据分析  51
  3 结果  51-56
    3.1 病毒早期基因 lef-3 转录水平的 qRT-PCR 分析  51-52
    3.2 病毒晚期基因 vp39 转录水平的 qRT-PCR 分析  52-54
    3.3 病毒极晚期基因 p10 转录水平的 qRT-PCR 分析  54-56
  4 讨论  56-57
第七章 lef-12 对 BmNPV 基因表达的影响  57-62
  1 材料与试剂  57-58
    1.1 材料  57
    1.2 主要试剂的配制  57-58
  2 方法  58-59
    2.1 收集病毒转染的 BmN 细胞  58
    2.2 Bradford 法进行蛋白定量  58
    2.3 Western blot 检测蛋白的表达  58-59
  3 结果  59-61
    3.1 LEF-12 的 Western blot 鉴定  59-60
    3.2 lef-12 对病毒晚期基因 vp39 和极晚期基因 p10 表达的影响  60-61
  4 讨论  61-62
第八章 BmNPV 的电子显微镜观察  62-65
  1 材料与试剂  62
    1.1 材料  62
    1.2 试剂配制  62
  2 电子显微镜分析  62-63
  3 结果  63-64
  4 讨论  64-65
结论  65-66
参考文献  66-72
致谢  72

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