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IBRV对牛单核巨噬细胞表达细胞因子的影响

作　者: 陈玉惠
导　师: 希尼尼根
学　校: 内蒙古农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: IBRV 单核巨噬细胞流式细胞术细胞因子
分类号: S858.23
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

牛传染性鼻气管炎(Infectious bovine rhinotracheitis, IBR)是一种牛的具有潜伏感染和持久感染特点,并能引起牛多系统感染的急性接触性传染病。本试验从牛外周血分离培养单核巨噬细胞,并对其进行形态学观察和流式细胞术鉴定；应用绝对荧光定量PCR方法检测牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis virus, IBRV)在单核巨噬细胞内的增殖规律；通过相对荧光定量PCR方法对牛单核巨噬细胞体外感染IBRV后,0、6、12、24及48h时表达IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α等细胞因子mRNA转录水平进行分析。试验结果如下：(1)通过密度梯度法分离培养的贴壁细胞,经过形态学观察和流式细胞术鉴定,确认为单核巨噬细胞。(2)IBRV感染体外培养的单核巨噬细胞后,在前6h增殖最快,之后增殖相对比较缓慢,在96h达到峰值,之后随着时间的增加,IBRV在巨噬细胞中的含量开始降低。(3) IBRV感染体外培养的单核巨噬细胞后,可以显著降低IL-4、IL-6和IL-8的mRNA转录水平(P<0.05)。(4) IBRV感染体外培养的单核巨噬细胞后,可以显著升高IL-10及TNF-α的mRNA转录水平(P<0.05)。本试验通过检测IBRV感染单核巨噬细胞后,IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α等细胞因子表达水平的动态变化,分析IBRV对牛单核巨噬细胞免疫学功能的影响,为进一步研究IBRV致病机理提供依据。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-12
1 引言  12-23
  1.1 IBR简介  12-13
    1.1.1 IBR发展简史  12
    1.1.2 IBR的感染与免疫  12-13
  1.2 IBRV研究进展  13-16
    1.2.1 分类与形态结构  13
    1.2.2 培养特性  13-14
    1.2.3 理化特性  14
    1.2.4 血清学  14
    1.2.5 分子特征  14-15
    1.2.6 编码蛋白概述  15-16
  1.3 单核巨噬细胞的生物学功能  16-17
    1.3.1 吞噬和杀伤功能  17
    1.3.2 加工和递呈抗原  17
    1.3.3 单核巨噬细胞分泌细胞因子与其它炎症介质  17
  1.4 IL-4的生物学功能  17-19
    1.4.1 IL-4对B细胞的作用  18
    1.4.2 IL-4对T细胞的作用  18
    1.4.3 IL-4对其他细胞的作用  18-19
    1.4.4 IL-4在肿瘤免疫中的作用  19
  1.5 IL-6的生物学功能  19-20
    1.5.1 免疫调节作用  19
    1.5.2 对造血细胞功能的影响  19
    1.5.3 保护神经细胞  19-20
  1.6 IL-8的生物学功能  20-21
    1.6.1 对中性粒细胞的作用  20
    1.6.2 对T淋巴细胞的作用  20
    1.6.3 对嗜碱性粒细胞的作用  20-21
  1.7 IL-10的生物学功能  21-22
    1.7.1 对T细胞的作用  21
    1.7.2 对B细胞的作用  21
    1.7.3 对髓样抗原递呈细胞的作用  21-22
    1.7.4 对自然杀伤(NK)细胞的作用  22
    1.7.5 对其他细胞的作用  22
  1.8 肿瘤坏死因子的生物学功能  22
  1.9 研究目的与意义  22-23
2 外周血来源的单核巨噬细胞的分离与鉴定  23-27
  2.1 材料和方法  23-25
    2.1.1 材料  23
    2.1.2 主要试剂及用品  23
    2.1.3 主要实验溶液  23
    2.1.4 主要实验仪器  23-24
    2.1.5 外周血来源的单核巨噬细胞的分离与培养  24
    2.1.6 细胞形态的观察  24
    2.1.7 细胞的流式细胞术鉴定  24-25
  2.2 结果  25-26
    2.2.1 形态观察结果  25-26
    2.2.2 流式细胞检测结果  26
  2.3 讨论  26-27
  2.4 小结  27
3 IBRV在外周血来源的单核巨噬细胞中的增殖规律  27-38
  3.1 材料与方法  27-33
    3.1.1 病毒和细胞  27-28
    3.1.2 主要试剂  28
    3.1.3 试验溶液  28
    3.1.4 主要仪器  28
    3.1.5 IBRV引物的设计  28-29
    3.1.6 IBRV的培养  29
    3.1.7 病毒半数细胞培养物感染量(TCID_(50))的测定  29
    3.1.8 荧光定量PCR方法检测IBRV标准曲线的建立  29-33
    3.1.9 IBRV在外周血来源的单核巨噬细胞中增殖规律的检测  33
  3.2 结果  33-37
    3.2.1 病毒培养结果  33
    3.2.2 TCID_(50)测定结果  33-34
    3.2.3 普通PCR扩增电泳结果  34
    3.2.4 菌落PCR扩增电泳结果  34-35
    3.2.5 测序结果  35
    3.2.6 IBRV荧光定量PCR标准曲线建立结果  35-36
    3.2.7 IBRV在巨噬细胞中的增殖规律结果  36-37
  3.3 讨论  37-38
  3.4 小结  38
4 荧光定量PCR检测IBRV感染牛单核巨噬细胞后IL-4、IL-6、IL-8、IL-10及TNF-α的表达动态  38-52
  4.1 材料与方法  39-41
    4.1.1 细胞  39
    4.1.2 主要试剂  39
    4.1.3 主要仪器及实验溶液  39
    4.1.4 引物的设计合成  39
    4.1.5 单核巨噬细胞总RNA的提取  39-40
    4.1.6 单核巨噬细胞总RNA反转录为cDNA  40-41
    4.1.7 IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α及β-actin的鉴定  41
    4.1.8 IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α及β-actin荧光定量PCR标准曲线的建立  41
    4.1.9 IL-4、IL-6、IL-8、IL-10及TNF-α动态变化检测  41
  4.2 结果  41-49
    4.2.1 各因子的标准曲线  41-46
    4.2.2 IL-4的mRNA转录水平  46-47
    4.2.3 IL-6的mRNA转录水平  47
    4.2.4 IL-8的mRNA转录水平  47-48
    4.2.5 IL-10的mRNA转录水平  48-49
    4.2.6 TNF-α的mRNA转录水平  49
    4.2.7 各因子的测序结果  49
  4.3 讨论  49-52
5 结论  52-53
致谢  53-54
参考文献  54-60
附录  60-63
作者简介  63

IBRV对牛单核巨噬细胞表达细胞因子的影响

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