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牛病毒性腹泻病毒E0基因重组乳酸菌的制备及其免疫效果检测

作　者: 蒋禄峰
导　师: 赵月兰
学　校: 河北农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 牛病毒性腹泻病毒嗜酸乳杆菌 pMG36e表达载体免疫保护
分类号: S858.23
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

牛病毒性腹泻是由牛病毒性腹泻病毒引起的临床上以发热、黏膜糜烂、溃疡、白细胞减少、腹泻、母畜流产或产畸型胎儿为主要特征。近年来我国乳牛进口数量急剧增加，该病已成为当前严重危害我国养殖业的传染病之一，给畜牧养殖业造成极为巨大的经济损失。对于本病目前仍无特效的治疗方法，因此加强对本病的研究就显得尤为重要。根据Genbank上发表的牛病毒性腹泻病毒Oregon C24V株E0基因的核苷酸序列设计一对特异性引物，应用PCR技术扩增牛病毒性腹泻病毒HB-DCZ株E0基因。将PCR产物克隆到PMD19-T载体，克隆产物进行序列测定与分析。结果：HB-DCZcDNA体外扩增获得特异性条带，大小约为687bp。序列测定结果表明，HB-DCZ株E0基因由681个核苷酸组成，编码227个氨基酸。与已公开发表的BVDV其他毒株核苷酸和推导氨基酸序列同源性性依次为：CCSYD99%、QHZK1098.4%以及VEDEVAC98.2%、C24V80.9%、Yak74.2%。HB-DCZ与CCSYD、QHZK10以及VEDEVAC株的遗传距离较近，与国际标准毒株C24V、Yak株的遗传距离较远。运用Kyte-Doolittle方案预测氨基酸的亲水性，采用Karplus-Schulz方案预测蛋白质的柔性区域，按Jameson-Wolf方案预测抗原指数，利用Emini方案预测蛋白质的表面可及性。对预测结果综合分析，推测最有可能的B细胞表位位于N-端6-17，23-29，47-53，59-68，70-81，97-109，114-122，127-134，137-143，165-172，186-198，213-220。通过SacI、HindIII限制性内切酶双酶切将目的基因E0整合入穿梭表达载体pMG36e中，连接产物通过KCM法转化到大肠杆菌DH5α中。提取阳性大肠杆菌pMG36e-E0/DH5α质粒进行双酶切及PCR鉴定；SDS-PAGE电泳和Western-blotting分析E0蛋白质的表达情况。从重组大肠杆菌中扩增得到687bp片段E0基因及经双酶切鉴定证明E0基因已经插入pMG36e载体中，构建的pMG36e-E0表达载体成功转入大肠杆菌中，表达出分子量约为27kDa的蛋白质，与核苷酸序列推断的蛋白大小相符。因此，成功构建了牛病毒性腹泻病毒E0表达载体，并在大肠杆菌中获得蛋白表达。采用电转化技术将己构建的牛病毒性腹泻病毒E0基因大肠杆菌重组表达质粒pMG36e-E0转化至嗜酸乳杆菌LA-5中。筛选阳性克隆,提取重组质粒进行双酶切鉴定与PCR鉴定；SDS-PAGE电泳和Western-blotting分析E0蛋白质的表达情况；对克隆菌进行遗传稳定性试验，分析重组质粒在嗜酸乳杆菌中的稳定性。从重组嗜酸乳杆菌中扩增得到一条大小约为690bp的片段及经双酶切鉴定证明pMG36e-E0表达载体成功电转化入嗜酸乳杆菌中，表达出分子量约为27kDa的蛋白质，与核苷酸序列推断的蛋白大小相符。证明牛病毒性腹泻病毒E0基因嗜酸乳杆菌表达系统被构建成功并获得蛋白表达。将重组pMG36e-E0嗜酸乳杆菌给6~8周龄的BALB/c小鼠灌服，每次连续口服免疫3d，每次免疫时间间隔为2周，共免疫3次。分别于免疫前、一免1、2、7d；二免前、二免1、2、7d；三免前、三免1、2、7d摘除眼球采集全血,并采集肠道内容物，检测中和抗体和slgA的水平。免疫结束后第7天对免疫组和对照组进行牛病毒性腹泻病毒攻毒试验。结果表明，灌服重组嗜酸乳杆菌组与各对照组比较，小鼠体内血清抗体和SlgA抗体水平显著提高(P<0.05)，各对照组间未发现有明显的变化；攻毒试验显示重组乳酸菌对牛病毒性腹泻的保护率（9/10）明显高于乳酸菌组（7/10）、空载体重组乳酸菌组（6/10）和生理盐水组（3/10），表明重组嗜酸乳杆菌对牛病毒性腹泻起到良好的免疫保护作用。本实验结果表明牛病毒性腹泻病毒E0基因在乳酸杆菌表达系统中能够表达，具有良好的免疫原性。E0基因工程乳酸菌给小鼠免疫后，具有较好的免疫效果。从而为进一步研究牛病毒性腹泻病毒基因工程乳酸菌口服疫苗奠定基础。

牛病毒性腹泻病毒E0基因重组乳酸菌的制备及其免疫效果检测

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