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甲巯咪唑分子印迹仿生酶联免疫分析方法建立

作　者: 唐伟伟
导　师: 王俊平
学　校: 天津科技大学
专　业: 食品科学
关键词: 甲巯咪唑分子印迹聚合物 BELISA 高效液相色谱
分类号: S859.84
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

近年来,动物性食品的安全性问题日益被世界所重视,由于我国的食品安全体系尚在建立中,一些不法生产者和经营企业在饲料中非法使用国家禁止或者不按照规定使用添加剂,有些甚至滥用导致畜产品中有毒有害物质的残留增加、严重超标等现象突出,严重影响了人们的身体健康。甲巯咪唑具有增进蛋白质代谢的作用从而被非法地作为饲料添加剂使用,食用残留有甲巯咪唑的动物性食品后会在人体内蓄积,对人体产生毒副作用。已有的文献中尚未发现用分子印迹技术与酶联免疫吸附技术相结合来检测甲巯咪唑的残留量的报道,本论文基于分子印迹技术和酶联免疫吸附法,针对动物性食品中的甲巯咪唑残留的检测,建立了价格低廉、快速、准确的检测方法。本文采用本体聚合技术,以甲巯咪唑为模板分子,甲基丙烯酸为功能单体,乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂,在96孔酶标板上直接紫外引发聚合制备了对甲巯咪唑具有选择识别能力的分子印迹聚合物,且对聚合反应条件进行了详细讨论；同时对印迹聚合物的平衡结合,吸附动力学和选择性能力进行了考察。实验结果表明,合成的聚合物对甲巯咪唑具有选择性高、传质速度和结合平衡速度快等诸多优点。印迹聚合物的饱和吸附容量Qmax为1.51μg well-1；在动力学实验中,吸附约40min即可达到吸附平衡。以该印迹膜作为仿生抗体,优化酶联免疫分析条件,建立了直接竞争仿生酶联免疫分析方法(BELISA).该方法对甲巯咪唑具有很高的选择性,对2-巯基咪唑等两种结构类似物的交叉反应率为1.1%-1.3%,灵敏度和最低检出限分别为70±4μg L-1和0.9±0.04g·L-1。为验证所建立方法的实用性,本文还同时对动物尿液样品和猪肉样品中的痕量甲巯咪唑的残留进行了检测分析。通过对检测为空白的尿液样品进行浓度为50,100,150μg L-1的添加,对检测为空白的猪肉样品进行10,20,30μg kg-1的添加,以所建立的分析方法进行检测,结果在尿液样品中各个添加浓度下样品中甲巯咪唑的回收率为90.0%-95.0%,在猪肉样品中的回收率为77.0%-89.0%。且测定结果与HPLC方法具有良好的一致性,从而说明所建立的检测方法的可行性。

全文目录

摘要  4-5
ABSTRACT  5-8
1 前言  8-25
  1.1 甲巯咪唑  8-10
    1.1.1 甲巯咪唑概述  8-9
    1.1.2 甲巯咪唑的副作用  9
    1.1.3 甲巯咪唑的检测方法  9-10
  1.2 分子印迹技术概述  10-18
    1.2.1 分子印迹技术的基本原理及其制备过程  10-12
    1.2.2 分子印迹聚合物的制备方法  12-13
    1.2.3 分子印迹物聚合方法种类  13-18
  1.3 分子印迹技术的应用  18-20
    1.3.1 在固相萃取中的应用  18
    1.3.2 仿生传感器  18-19
    1.3.3 膜分离  19
    1.3.4 选择性催化作用  19
    1.3.5 色谱分离  19-20
  1.4 酶联免疫吸附测定法概述  20-24
    1.4.1 酶联免疫吸附测定法的基本原理  20-21
    1.4.2 酶联免疫吸附测定法的类型  21
    1.4.3 酶联免疫吸附技术要点  21-22
    1.4.4 酶联免疫吸附法的特点及存在的问题  22
    1.4.5 分子印迹免疫分析原理  22
    1.4.6 分子印迹免疫吸附检测技术的应用  22-23
    1.4.7 存在的问题  23-24
  1.5 论文研究目的意义及主要内容  24-25
2 材料与方法  25-32
  2.1 实验材料  25-27
    2.1.1 主要药品和试剂  25
    2.1.2 仪器设备  25-27
    2.1.3 主要溶液的配制  27
  2.2 实验方法  27-32
    2.2.1 甲巯咪唑仿生抗体前躯体的制备  27
    2.2.2 模板分子的洗脱  27
    2.2.3 甲巯咪唑分子印迹聚合物的红外光谱分析  27-28
    2.2.4 甲巯咪唑标准曲线的绘制及吸附容量(Q)的计算  28
    2.2.5 甲巯咪唑半抗原的合成和酶标的连接  28-29
    2.2.6 直接竞争BELISA方法操作步骤  29-30
    2.2.7 紫外分光光度计测试条件的确定及吸附介质的选择  30
    2.2.8 甲巯咪唑分子印迹聚合物膜的性能表征  30
    2.2.9 BELISA标准溶液的建立  30-31
    2.2.10 方法特异性实验  31
    2.2.11 实验样品的准备及添加回收实验  31
    2.2.12 液相色谱方法验证  31-32
3 结果与讨论  32-49
  3.1 影响分子印迹聚合物合成和吸附性能的因素  32-35
    3.1.1 反应溶剂、功能单体、交联剂的选择  32-33
    3.1.2 模板分子、功能单体及交联剂的配比  33-34
    3.1.3 模板分子的敲除  34-35
  3.2 傅立叶红外光谱分析  35-36
  3.3 聚合物表征实验  36-41
    3.3.1 紫外检测条件的确定  36-38
    3.3.2 甲巯咪唑标准曲线的绘制  38
    3.3.3 印迹聚合物对甲巯咪唑的平衡结合实验  38-39
    3.3.4 印迹聚合物膜对甲巯咪唑的动力学实验  39-40
    3.3.5 结构分析  40-41
  3.4 半抗原的合成  41-42
  3.5 BELISA条件优化  42-43
    3.5.1 酶标浓度的优化  42-43
    3.5.2 聚合时间的影响  43
  3.6 BELISA方法的分析特征量  43-44
  3.7 BELISA方法的选择性  44-45
  3.8 仿生抗体的重复利用  45-46
  3.9 实际样品测定  46
  3.10 BELISA方法的准确性  46-49
4 结论  49-50
5 展望  50-51
6 参考文献  51-60
7 攻读硕士学位期间发表论文情况  60-61
8 致谢  61

甲巯咪唑分子印迹仿生酶联免疫分析方法建立

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