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ANS、ANR和LAR基因在草莓花青素代谢途径中的调控作用

作　者: 张晓楠
导　师: 汤浩茹
学　校: 四川农业大学
专　业: 果树学
关键词: 草莓花青素苷原花青素 FaANS FaANR FaLAR 表达
分类号: S668.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

草莓(Fragariaan×ananassa Duch.)属蔷薇科草莓属多年生草本植物,其果实色泽鲜艳粉红,果肉多汁,芳香宜人,营养丰富,酸甜适口,深受广大消费者的喜爱。草莓果实中所含的花青素苷不仅能呈现优异的色泽,还表现出了较多的生理功能,它可以清除人体内的自由基；降低氧化酶的活性；可以增强免疫功能；抗变异、抗肿瘤、抗过敏、保护胃黏膜等多种功能,花青素苷作为一种高附加值的原料或功能性食品基料,其应用前景是非常广阔的。另外,草莓果实中所含的原花青素作为一种聚多酚类化合物,具有抗氧化、抗血栓、清除自由基等作用,在草莓的生长发育和与环境的相互作用中也发挥着重要的功效。本试验以花青素苷及原花青素含量极其丰富的草莓栽培品种‘丰香’(Fragaria×ananassa cv. Toyonaka)作为材料,分析了花青素代谢途径中三个关键酶基因FaANS、FaANR和FaLAR在草莓果实不同发育阶段的表达情况,并测定了‘丰香’草莓果实不同发育阶段花青素苷和原花青素的总含量,并简单分析了他们之间的相关性,主要得到了以下研究结果：1.本试验采用改良的CTAB法提取了高质量的草莓果实不同发育时期的总RNA。2.分别采用pH示差法和DMACA化学反应法测定了不同发育时期草莓果实花青素苷和原花青素的总含量。研究结果表明：在草莓果实发育初期,花青素苷的含量比较低,随着果实的发育成熟,花青素苷则大量积累,到完全成熟期达到了最大值(18.61mg·g-1FW)。然而花青素的积累却与之相反。在草莓果实的发育初期,原花青素的含量最高(26.27mg·g-1FW),随着果实的发育成熟,原花青素的含量开始逐渐减少,到果实完全成熟时,原花青素的含量也降到了最低值(3.13mg·g1FW)。3.用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术检测了FaANS、FaANR和FaLAR三个基因在草莓果实不同发育时期的表达情况,并结合已测定的花青素苷和原花色素的总含量进行了相关性分析。研究结果表明：FaANS基因的表达模式跟草莓果实中花色素苷的积累模式相符,随着果实的发育成熟呈上升趋势,在果实的小绿期,FaANS基因表达水平较低,在果实完全成熟时(全红期)其表达量达到最高水平。而FaANR和FaLAR基因在果实发育初期(小绿期)表达水平较高,随着草莓果实的发育成熟,在果实的全红期其表达量最低,这跟果实中原花青素的积累模式是一致的。

全文目录

摘要  7-9
Abstract  9-13
1 文献综述  13-22
  1.1 引言  13-14
  1.2 国内外关于该课题的研究现状及趋势  14-22
    1.2.1 ANS、ANR和LAR在植物类黄酮代谢途径中的位置  14-16
    1.2.2 植物ANS、ANR和LAR基因的有关研究  16-19
      1.2.2.1 植物ANS基因的克隆及序列特征  16-17
      1.2.2.2 植物ANR基因的分子特性  17-18
      1.2.2.3 植物LAR基因的分子特性  18-19
    1.2.3 植物ANS、ANR和LAR基因的表达调控  19-22
      1.2.3.1 植物ANS基因的表达调控  19-20
      1.2.3.2 植物ANR基因的表达调控  20-21
      1.2.3.3 植物LAR基因的表达调控  21-22
2 研究目标、研究内容和解决的关键问题  22-24
  2.1 研究目标  22-23
  2.2 研究内容  23
  2.3 解决的关键问题  23-24
3 试验材料和方法  24-35
  3.1 试验材料  24-27
    3.1.1 植物材料  24
    3.1.2 试剂和试剂盒  24
    3.1.3 溶液和缓冲液的配制  24-27
  3.2 仪器设备  27-28
  3.3 实验方法  28-35
    3.3.1 花青素的提取  28-29
      3.3.1.1 花青素提取液的配制  28
      3.3.1.2 花青素的提取方法  28
      3.3.1.3 用pH示差法测定花青素的总含量  28-29
    3.3.2 标准曲线的测定及原花青素的提取方法  29-30
      3.3.2.1 原花青素的提取液的配制  29
      3.3.2.2 标准曲线的测定  29
      3.3.2.3 原花青素的提取方法  29
      3.3.2.4 比色法测定原花青素的总含量  29-30
      3.3.2.5 数据分析  30
    3.3.3 草莓果实不同发育时期总RNA的提取  30-31
    3.3.4 电泳技术  31
    3.3.5 RNA OD值的测定  31-32
    3.3.6 用DNase处理提取的RNA  32
    3.3.7 反转录  32-33
    3.3.8 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)引物的设计与合成  33-34
    3.3.9 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)反应程序及体系  34
    3.3.10 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)数据分析  34-35
4 结果与分析  35-44
  4.1 草莓果实发育过程中花青素苷的代谢变化  35-36
  4.2 草莓果实发育过程中原花青素的代谢变化  36-38
  4.3 草莓果实RNA提取结果及cDNA质量检测  38-39
    4.3.1 改良的CTAB法提取草莓果实RNA结果  38
    4.3.2 RNA质量的进一步检测：cDNA质量检测  38-39
  4.4 FaANS、FaANR和FaLAR基因在草莓果实成熟过程中的表达模式  39-43
    4.4.1 FaANS、FaANR和FaLAR基因的熔解曲线  39-40
    4.4.2 FaANS基因在草莓果实成熟过程中的表达量分析  40-41
    4.4.3 FaANR和FaLAR基因在草莓果实成熟过程中的表达量分析  41-43
  4.5 FaANS、FaANR和FaLAR三个基因的表达与产物积累的相关性分析  43-44
5 讨论  44-50
  5.1 RNA的提取与检测  44-45
  5.2 实时荧光定量PCR注意事项  45-47
    5.2.1 定量PCR引物的设计  45-46
    5.2.2 定量PCR防止污染的方法  46
    5.2.3 定量PCR反应中模板的选择  46-47
    5.2.4 定量PCR反应中退火温度的选择  47
  5.3 果实成熟过程中花青素苷与原花青素的代谢变化  47-49
  5.4 FaANS、FaANR和FaLAR三个基因表达量的相关分析  49-50
6 小结  50-51
7 进一步研究的内容  51-52
参考文献  52-61
致谢  61-62
硕士期间发表论文情况  62

ANS、ANR和LAR基因在草莓花青素代谢途径中的调控作用

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