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黄瓜离体再生和遗传转化体系的建立

作　者: 吴振
导　师: 黄三文
学　校: 南京农业大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 黄瓜离体培养遗传转化 Bi基因植株再生
分类号: S642.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

黄瓜是一类重要的蔬菜作物,在世界上被广泛栽培。随着分子生物学技术的发展,遗传转化技术已成为许多作物品种改良的重要手段。可是,在黄瓜上无论是组培技术还是遗传转化技术都不够成熟,影响了这些技术在黄瓜育种中的应用。Bi基因是控制黄瓜苦味性状的显性基因。黄瓜苦味会严重影响黄瓜的口感,是黄瓜育种中需要改良的性状。本研究以欧洲温室型黄瓜G8、川白1792、9930、版纳黄瓜为试材,建立了各自适合的再生体系。在此基础上,利用农杆菌介导法将苦味基因Bi导入黄瓜中,获得转Bi基因黄瓜植株。主要结果如下：1,以子叶块为外植体建立了适合不同基因型黄瓜的离体再生体系。不同品种对培养基的要求存在差异,其中G8的最适出芽培养基配方为MS+1.5mg/l6-BA+0.5mg/l ABA+2.0mg/lAgNO3,每外植体平均再生芽数为4.6个；川白1792和9930的最适培养基配方为MS+2.0mg/16-BA+1.0mg/l ABA+2.0mg/lAgNO3,每外植体平均再生芽数分别为6.5个和5.1个；版纳黄瓜的最适出芽培养基配方为MS+1.0mg/16-BA+0.5mg/l ABA+2.0mmg/lAgNO3,每外植体平均再生芽数为3.7个。2,遗传转化与转Bi基因植株再生。优化了欧洲温室型黄瓜G8的遗传转化体系,结果表明,侵染时间为15min,AS浓度为20uM,是适合的转化条件。获得了PCR鉴定10株Bi转基因黄瓜植株,对其中3株进行了荧光定量PCR以及叶子中葫芦素C液相色谱的分析,结果表明Bi在转基因黄瓜植株增加表达。

全文目录

摘要  8-9
ABSTRACT  9-10
英文缩略表  10-11
第一章综述  11-27
  1.1 黄瓜离体培养研究进展  11-16
    1.1.1 植物离体再生途径  11-12
    1.1.2 黄瓜离体培养的影响因素  12-16
      1.1.2.1 基因型  12-13
      1.1.2.2 苗龄  13
      1.1.2.3 外植体  13-14
      1.1.2.4 激素  14-16
      1.1.2.5 硝酸银  16
  1.2 黄瓜遗传转化研究进展  16-24
    1.2.1 遗传转化的方法  16-21
      1.2.1.1 农杆菌介导法  16-20
        1.2.1.1.1 根癌农杆菌介导的原理  17-18
        1.2.1.1.2 影响农杆菌T-DNA转移的因素  18-20
      1.2.1.2 脂质体转化法  20
      1.2.1.3 基因枪法  20
      1.2.1.4 花粉管通道法  20
      1.2.1.5 Floral dip法  20
      1.2.1.6 超声波法  20-21
    1.2.2 黄瓜遗传转化应用现状  21-24
      1.2.2.1 黄瓜抗病虫遗传转化研究  21-22
      1.2.2.2 黄瓜抗逆遗传转化研究  22-23
      1.2.2.3 其它  23-24
  1.3 Bi基因研究概况  24-25
  1.4 研究目的与意义  25-27
第二章黄瓜再生体系的优化  27-35
  2.1 材料与方法  27
    2.1.1 材料  27
  2.2 无菌苗的培养  27
    2.2.1 种子催芽  27
    2.2.2 外植体的选择与处理  27
  2.3 芽诱导培养  27-29
  2.4 芽伸长培养  29
  2.5 生根培养  29
  2.6 结果和分析  29-33
    2.6.1 激素对黄瓜子叶块离体再生的影响  32
    2.6.2 基因型对子叶块离体再生的影响  32-33
    2.6.3 6-BA和GA_3对不定芽伸长的影响比较  33
    2.6.4 再生植株的生根  33
  2.7 讨论  33-35
第三章 BI基因表达载体的构建  35-41
  3.1 材料  35-36
    3.1.1 菌株与载体  35
    3.1.2 培养基及生化试剂  35-36
  3.2 方法  36-38
    3.2.1 总RNA的提取  36
    3.2.2 总RNA定量与完整性检测  36
    3.2.3 cDNA第一链的合成  36
    3.2.4 Bi基因的获得  36-37
    3.2.5 Bi表达载体的构建  37
    3.2.6 农杆菌的转化  37-38
  3.3 结果与分析  38-41
    3.3.1 pCMBIA1300-Bi表达载体的构建  38-39
    3.3.2 pCAMBIA1300-Bi的农杆菌转化  39-41
第四章 BI基因的遗传转化  41-53
  4.1 材料  41
    4.1.1 植物材料  41
    4.1.2 培养基及其它生化试剂  41
  4.2 农杆菌菌液的制备  41-42
  4.3 Bi转化黄瓜G8  42-43
    4.3.1 潮霉素(Hyg)选择压的确定  42
    4.3.2 外植体预培养  42
    4.3.3 农杆菌侵染及共培养  42
    4.3.4 再生植株的抗性筛选  42-43
  4.4 转基因植株的PCR检测  43
    4.4.1 抗性植株总DNA的提取  43
    4.4.2 目的基因的PCR扩增  43
  4.5 Bi差异表达分析  43-44
    4.5.1 总RNA的提取  43-44
    4.5.2 cDNA第一条链的合成  44
    4.5.3 实时荧光定量PCR  44
  4.6 结果和分析  44-50
    4.6.1 潮霉素(Hyg)对外植体分化的影响  44-45
    4.6.2 侵染时间对抗性芽再生的影响  45-46
    4.6.3 共培养基中附加AS对抗性芽再生的影响  46-47
    4.6.4 转Bi基因黄瓜植株的获得与分子鉴定  47-50
      4.6.4.1 转基因黄瓜植株的获得  47
      4.6.4.2 转基因黄瓜植株的PCR检测  47-48
      4.6.4.3 转基因黄瓜植株BimRNA的表达分析  48
      4.6.4.4 转Bi基因黄瓜植株叶子中萌声素C液相色谱测分析  48-50
  4.7 讨论  50-53
全文结论  53-55
参考文献  55-63
附录  63-69
致谢  69

黄瓜离体再生和遗传转化体系的建立

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