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黄瓜花叶病毒基因时序表达及其对寄主miRNAs和靶标mRNAs表达的影响

作　者: 赖雷雨
导　师: 陈集双；冯俊丽
学　校: 浙江理工大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 黄瓜花叶病毒卫星RNA 病害症状番茄miRNA 基因表达
分类号: S432.41
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

病毒侵染通常会破坏寄主植物正常的生理活动,导致植物异常症状产生,从叶片黄化到植株发育异常甚至整株死亡。黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)是目前世界上发生最广泛、对农作物危害最严重的植物病毒。卫星RNA(satellite RNA,satRNA)对CMV引起的寄主症状往往具有减弱作用,也有一些satRNAs对CMV的致病性没有明显影响,或具有明显的加重作用。近年来,越来越多的研究表明,在病毒侵染寄主诱导症状产生的过程中,植物体内的小RNA分子起着重要作用,其中主要是microRNAs(miRNAs)和small interfering RNAs(siRNAs)。miRNAs是非编码的小RNA,广泛存在植物组织中,它们基于与靶标mRNA的序列互补,可以对靶标mRNA的表达进行调控。与其他环境胁迫因子相似,病毒侵染导致寄主植物症状的产生是由许多基因表达调控因子和信号通路交互作用的结果,而miRNAs在此过程中的机理尚未完全清楚。这一方面由于对miRNA的检测有困难,仍有部分miRNAs尚未被认识到;另一方面不同的病毒致病决定因子对寄主抗病毒RNA沉默途径的干扰机制不同。本研究应用实时荧光定量PCR(Real-time RT-PCR)技术,研究了CMV国际标准株系CMV-Fny、基因突变体CMV-FnyΔ2b、添加致弱卫星的CMV-Fny-satYn12、添加非致弱卫星的CMV-Fny-satT1以及番茄不孕病毒(Tomato aspermy virus,TAV)侵染番茄后,寄主miRNA及其靶标mRNA表达量的特异性变化,结合CMV-Fny基因表达量的差异变化情况,探讨CMV致病决定子2b蛋白以及其寄生因子satRNAs干扰寄主miRNA沉默途径的作用,从病毒基因表达量和寄主miRNA及其靶标mRNA表达量方面来分析病毒侵染导致寄主症状产生的原因。研究结果显示,添加两种卫星后,辅助病毒的病毒基因都降低了;相比于非致弱卫星T1,致弱卫星Yn12对辅助病毒CMV-Fny的病毒基因表达量有更大程度的降低。所检测的番茄叶片组织中的11条miRNAs和10条靶标mRNAs的表达量在CMV-Fny和TAV-Bj侵染后都有了不同程度的上升。添加satYn12后明显地抑制了辅助病毒对miRNAs表达量的上调程度,而添加satT1并未明显改变辅助病毒对寄主miRNAs的影响。缺失2b基因的CMV- FnyΔ2b侵染后番茄叶片中的病毒基因表达量很低,与Mock相当,其对寄主miRNA及靶基因的表达量也几乎没有影响,显示出CMV 2b基因在致病过程中的重要性。这些结果为揭示卫星对CMV致病性影响的关系、植物miRNAs及其靶标mRNAs与病毒侵染的关系进而阐明病毒-寄主互作的分子机制提供了一些理论依据。

全文目录

略语表  8-9
摘要  9-11
Abstract  11-15
第一章文献综述  15-26
  1.1 黄瓜花叶病毒  15-18
    1.1.1 CMV 概述  15
    1.1.2 CMV 基因组结构及其功能  15-16
    1.1.3 CMV 卫星RNA  16-18
  1.2 miRNAs 概述  18-22
    1.2.1 RNA 沉默与miRNA 的发现  18-19
    1.2.2 miRNA 在植物中的分布  19-20
    1.2.3 植物miRNA 的形成与调控  20-21
    1.2.4 植物miRNA 的功能  21-22
      1.2.4.1 miRNA 参与植物的生长发育  21
      1.2.4.2 miRNA 参与叶和根的发育  21-22
      1.2.4.3 miRNA 参与花的发育及性别决定  22
      1.2.4.4 miRNA 参与植物的信号转导  22
      1.2.4.5 miRNA 在其他方面的功能  22
  1.3 番茄及侵染番茄植株的主要病毒  22-23
  1.4 病毒-寄主互作与miRNA 调控途径的关系  23-24
  1.5 实时荧光定量PCR 技术  24-25
  1.6 本论文的研究内容与目的  25-26
    1.6.1 本论文的研究内容  25
    1.6.2 本论文的研究目的及意义  25-26
第二章黄瓜花叶病毒基因时序表达差异与致病相关性研究  26-41
  2.1 材料与方法  27-33
    2.1.1 寄主植物  27
    2.1.2 病毒接种  27
    2.1.3 酶与试剂  27-28
    2.1.4 T1-satRNA 和Yn12-satRNA 的体外转录  28-29
    2.1.5 大量抽取植物中黄瓜花叶病毒双链RNA  29
    2.1.6 植物总RNA 提取  29-31
    2.1.7 引物的筛选  31
    2.1.8 RT-PCR 扩增  31-32
    2.1.9 荧光定量PCR  32
    2.1.10 数据处理  32-33
  2.2 结果与分析  33-39
    2.2.1 致弱卫星Yn12 和非致弱卫星T1 的体外转录  33-34
    2.2.2 病毒侵染后在番茄上引起的症状  34
    2.2.3 病毒侵染番茄35 天后抽dsRNA 结果  34-35
    2.2.4 荧光定量PCR 扩增引物的验证  35-37
    2.2.5 荧光定量PCR 分析不同CMV-Fny 基因时序表达差异  37-39
  2.3 小结与讨论  39-41
第三章病毒侵染引起番茄miRNA 差异表达的研究  41-53
  3.1 材料方法  42-45
    3.1.1 寄主和毒源  42
    3.1.2 酶与试剂  42
    3.1.3 总RNA 提取  42
    3.1.4 miRNA 引物设计  42-44
    3.1.5 cDNA 第一链的合成  44
    3.1.6 荧光定量PCR 过程  44-45
    3.1.7 荧光定量PCR 结果的处理  45
  3.2 实验结果  45-50
    3.2.1 侵染病毒后番茄症状  45-46
    3.2.2 引物扩增特异性的验证  46-48
    3.2.3 miRNAs 的real-time RT-PCR 检测结果  48-49
    3.2.4 miRNA 检测结果分析  49-50
  3.3 小结与讨论  50-53
第四章番茄miRNA 的靶标m RNA 对病毒侵染的响应  53-63
  4.1 材料与方法  54-56
    4.1.1 寄主和毒源  54
    4.1.2 酶与试剂  54
    4.1.3 总RNA 提取  54
    4.1.4 引物设计  54
    4.1.5 cDNA 第一链的合成  54-55
    4.1.6 荧光定量PCR 过程  55-56
    4.1.7 荧光定量PCR 结果的处理  56
  4.2 实验结果  56-60
    4.2.1 侵染病毒番茄症状  56
    4.2.2 引物扩增特异性的验证  56-58
    4.2.3 靶基因的real-time RT-PCR 检测结果  58-59
    4.2.4 靶基因检测结果分析  59-60
  4.3 小结与讨论  60-63
总结  63-65
参考文献  65-70
附录：重要溶液的配制  70-71
致谢  71-72
攻读硕士学位期间的研究成果  72

黄瓜花叶病毒基因时序表达及其对寄主miRNAs和靶标mRNAs表达的影响

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