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虎杖的悬浮细胞培养和白藜芦醇含量的变化

作　者: 王丹丹
导　师: 李兴林
学　校: 天津科技大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 虎杖愈伤组织细胞悬浮培养白藜芦醇 HPLC
分类号: S567.19
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 16次
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内容摘要

为了探索工业化生产植物次生代谢产物白藜芦醇的新途径,本文以虎杖(Polygonum cuspidatum)幼苗细胞为研究对象,建立并优化虎杖幼苗细胞悬浮培养体系。通过单因子试验和正交试验,分别对虎杖愈伤组织诱导、悬浮细胞系的初步建立、细胞悬浮培养基及白藜芦醇含量的变化等方面进行了研究。本实验以虎杖的茎尖、幼叶及茎段分别作为外植体,在不同激素组合的培养基上进行愈伤组织的诱导和继代培养；并利用获得的松散的愈伤组织在不同条件下建立细胞悬浮培养体系；在整个过程中利用高效液相色谱法(HPLC)测定白藜芦醇的含量。以虎杖茎尖为外植体时,诱导的愈伤组织的出愈率偏低,以幼叶及茎段为外植体时,愈伤组织的出愈率均大于茎尖的出愈率,且幼叶的愈伤组织最高诱导率为100%,茎段的愈伤组织最高诱导率为97%。利用幼叶和茎段获得松散愈伤组织时其诱导及继代培养基组成是MS培养基+2,4-D4.0mg/L+6-BA2.0mg/L。单因子及正交试验结果证明,虎杖细胞悬浮培养最佳的培养体系为：以幼叶在基本培养基MS培养基十2,4-D4.0mg/L+6-BA2.0mg/L上诱导的愈伤组织为起始细胞；接种量为60%(20mL液体接种12mL);25℃、振荡速度为120r/min;并在培养的第3d添加2mL的1mol/L的NH4CL溶液、第9d添加4mL的1mol/L蔗糖溶液。此时的白藜芦醇达到63.5μg/g,细胞干重为45.5mg/mL。本文通过虎杖形成愈伤组织外植体的筛选、松散型愈伤组织的获得和细胞悬浮培养基和培养条件的优化,为大规模工业化生产白藜芦醇积累了初步的实验参数。

全文目录

摘要  4-5
ABSTRACT  5-9
1 前言  9-21
  1.1 植物细胞悬浮培养的发展与现状  9
  1.2 植物细胞悬浮培养的特点  9-10
  1.3 植物细胞悬浮培养体系的建立  10-12
    1.3.1 愈伤组织的诱导  10-11
    1.3.2 悬浮培养的起始  11
    1.3.3 悬浮培养的继代  11
    1.3.4 悬浮培养的同步化  11-12
  1.4 培养悬浮细胞生长的测定  12-13
    1.4.1 悬浮细胞重量的测定  13
    1.4.2 悬浮液压缩细胞体积(PVC)的测定  13
    1.4.3 悬浮培养系中细胞密度的测定  13
  1.5 影响细胞悬浮培养的条件  13-16
    1.5.1 光照  13
    1.5.2 度  13-14
    1.5.3 培养基的pH  14
    1.5.4 环境中的气体成分  14
    1.5.5 接种量  14-15
    1.5.6 剪切力  15
    1.5.7 激素水平  15-16
    1.5.8 糖浓度  16
  1.6 虎杖细胞悬浮培养  16
  1.7 白藜芦醇的性质  16-17
  1.8 白藜芦醇的提取  17
  1.9 白藜芦醇的测定方法  17-18
  1.10 白藜芦醇的药用价值  18-19
  1.11 制备白藜芦醇的途径  19
    1.11.1 从天然植物体中提取白藜芦醇  19
    1.11.2 化学合成白藜芦醇  19
    1.11.3 生物合成白藜芦醇  19
  1.12 白藜芦醇的应用现状及前景  19-20
    1.12.1 白藜芦醇在保健食品方面的应用  19
    1.12.2 白藜芦醇在化妆品中的应用  19
    1.12.3 白藜芦醇在药物上的应用  19-20
  1.13 本论文研究的目的和主要内容  20-21
    1.13.1 本论文研究的目的和意义  20
    1.13.2 本论文研究的内容  20-21
2 材料与方法  21-30
  2.1 试验原料  21
  2.2 试验试剂与仪器  21-23
    2.2.1 试验试剂  21-22
    2.2.2 实验仪器与设备  22-23
  2.3 虎杖外植体愈伤组织的诱导与继代  23-25
    2.3.1 虎杖外植体部位的选择及预处理  23
    2.3.2 虎杖外植体诱导愈伤组织与诱导培养基的选择  23-24
    2.3.3 虎杖愈伤组织的继代与继代培养基的选择  24-25
  2.4 虎杖细胞悬浮培养体系的建立与继代  25-26
    2.4.1 悬浮培养体系细胞密度的测定  25-26
    2.4.2 悬浮培养体系细胞生长曲线的制作  26
    2.4.3 悬浮细胞体系细胞干重的测定  26
  2.5 虎杖细胞悬浮培养体系白藜芦醇含量的测定  26-27
    2.5.1 白藜芦醇标准曲线的制作  26
    2.5.2 悬浮培养体系中白藜芦醇的提取方法  26-27
    2.5.3 悬浮培养体系中白藜芦醇含量的测定方法  27
  2.6 虎杖悬浮培养体系pH的测定  27
  2.7 在一个悬浮培养周期中悬浮培养体系各个因子的变化规律  27
  2.8 影响虎杖细胞悬浮培养的各个单因素试验  27-28
    2.8.1 不同接种量对悬浮培养体系的影响  27
    2.8.2 培养基初始pH对悬浮培养体系的影响  27
    2.8.3 温度对悬浮培养体系的影响  27
    2.8.4 摇床震荡速度对悬浮培养体系的影响  27-28
    2.8.5 不同碳源对悬浮培养体系的影响  28
    2.8.6 不同氮源对悬浮培养体系的影响  28
  2.9 影响虎杖细胞悬浮培养各个因素的正交试验  28
  2.10 悬浮培养体系中碳源和氮源的添加时期和添加量的确定  28-30
    2.10.1 悬浮培养体系中蔗糖的添加时期和添加量的确定  28-29
    2.10.2 悬浮培养体系中氯化铵的添加时期和添加量的确定  29-30
3 结果与讨论  30-55
  3.1 白藜芦醇含量的标准曲线  30
  3.2 虎杖愈伤组织的诱导与继代培养  30-33
    3.2.1 虎杖愈伤组织的诱导  30-33
    3.2.2 虎杖愈伤组织的继代培养  33
    3.2.3 虎杖外植体和其愈伤组织培养过程中白藜芦醇的积累  33
  3.3 虎杖悬浮培养的细胞生长曲线和测定指标的变化  33-36
    3.3.1 悬浮培养的细胞密度变化  33-34
    3.3.2 悬浮培养的细胞干重、白藜芦醇含量和pH变化  34-36
  3.4 虎杖细胞悬浮培养的培养基的培养条件优化  36-55
    3.4.1 接种量对悬浮培养体系的影响  36-38
    3.4.2 培养基初始pH对悬浮培养体系的影响  38
    3.4.3 温度对悬浮培养体系的影响  38-40
    3.4.4 摇床震荡速度对悬浮培养体系的影响  40-42
    3.4.5 碳源对悬浮培养体系的影响  42-44
    3.4.6 氮源对悬浮培养体系的影响  44-46
    3.4.7 虎杖细胞悬浮培养主要影响因子的正交试验  46-48
    3.4.8 碳源和氮源添加时间和添加量对悬浮培养体系的影响  48-55
4 结论  55-56
5 展望  56-57
6 参考文献  57-63
7 论文发表情况  63-64
8 致谢  64

虎杖的悬浮细胞培养和白藜芦醇含量的变化

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