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水分胁迫下外源脱落酸提高甘蔗抗旱性的机理研究

作　者: 李长宁
导　师: 李杨瑞
学　校: 广西大学
专　业: 作物栽培学与耕作学
关键词: 甘蔗 脱落酸 水分胁迫 生物合成 基因芯片 信号转导
分类号: S566.1
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


甘蔗是中国第一大糖料作物,甘蔗糖占我国食糖总产量90%以上,而我国甘蔗种植面积80%以上为丘陵旱地,蔗区农业水利条件较差,降水不均衡,土壤保水能力差,每年都面临不同程度干旱威胁。选育抗旱性强、水分利用率高的甘蔗品种是我国甘蔗糖业可持续发展的重要保证,但由于甘蔗遗传背景复杂,通过常规杂交育种方法进行甘蔗遗传改良所需周期比较长,亟需其它辅助手段解决甘蔗抗旱性问题。本研究选用甘蔗品种桂糖21号(GT21),比较在进行水分胁迫和胁迫加喷施外源脱落酸(ABA)处理条件下,甘蔗叶片内相关生理生化变化及其与抗旱性的关系,运用基因芯片比较两处理条件下差异表达基因异同并筛选ABA诱导基因,对ABA合成及信号转导过程关键基因进行克隆及表达分析,主要研究内容和结果如下：1.以GT21为材料,研究水分胁迫及胁迫加叶面喷施ABA对甘蔗内源ABA含量及相关生理生化指标的影响,结果表明,干旱及干旱加外施ABA条件下,甘蔗内源ABA含量水平上升,但干旱加ABA处理增幅更显著,甘蔗叶片相对含水量随着胁迫加剧而逐渐下降,外施ABA能提高甘蔗保水能力。水分胁迫下,甘蔗叶内脯氨酸、可溶性蛋白、H2O2、丙二醛(MDA)含量增加,ABA处理能使渗透调节物质含量处于更高水平,并降低MDA含量,缓解其积累给细胞带来的伤害。水分胁迫及ABA处理均能提高GT21叶片中IAA含量而降低GA含量。ABA处理能防止叶绿素降解并对干旱引起的最大光能转化效率(Fv/Fm)、最大光化学效率(Fv’/Fm’)、光系统II实际量子效率(PS2)下降有明显缓解作用。在干旱条件下,H2O2积累伴随着抗氧化系统相关酶CAT、GPX、GR和APX活性提高,ABA处理能进一步提高上述酶活性而使活性氧清除能力得到增强,表明在干旱条件下,外施ABA处理能增强甘蔗抗氧化防护系统,从而提高其抗旱性。2.以已发表的NCED蛋白序列保守区域为模板,设计简并引物,运用RT-PCR方法,从GT21中克隆得到NCED基因序列表达标签后,采用RACE-PCR技术,扩增出该基因全长cDNA序列并命名为SoNCED。序列分析表明SoNCED全长2521bp,包含长度为1827bp的开放阅读框,编码608个氨基酸,推导氨基酸序列分子量65.9kDa,等电点6.04,聚类分析表明其与玉米和高梁等同属C4植物的NCED进化关系较近。生物信息学分析表明,SoNCED的N末端有典型叶绿体转运肽结构,组成其基本二级结构的α-helices、β-strands、β-propeller、与铁离子结合起催化作用的组氨酸位点,α-helices结构中富含疏水氨基酸残基等,性质高度保守。实时荧光定量PCR分析结果表明,25%PEG-6000模拟干旱胁迫处理、对照加ABA及干旱加ABA处理下,GT21叶片及根系SoNCED都随着02-产生速率升高表达量显著上升,并与ABA含量增长具有协同效应,表明SoNCED参与甘蔗叶片及根系内源ABA合成调控。3.应用安捷伦4x44K基因芯片研究水分胁迫及胁迫加叶面喷施ABA对甘蔗基因表达的影响,结果表明,ABA处理在第3、第5天差异表达基因数量均高于单施干旱处理；胁迫前期,两处理差异基因以上调表达为主,后期下调表达占多数。从ABA处理第3天的样品中筛选到231个ABA响应基因,与第5天各处理差异基因相比,其中71个基因只在ABA处理第3天表达,72个在所有处理中共表达,38个只在ABA处理第3、第5天共表达,50个只在干旱处理第5天表达。使用BlastX对上述231个基因进行功能注释,共获得有效注释信息基因173个,基因功能分类结果表明,功能未知的假定蛋白所占比例最高,约占总数10%；参与脂类代谢、信号转导,编码蛋白激酶和渗透调节物质基因所占比例次之,都约占9%；参与蛋白质代谢、ABA代谢基因约占总数的6%；与光合作用、碳水化合物代谢、转运蛋白相关的基因分别约占5%；其它差异表达基因参与的功能还有呼吸作用、转录因子、激素代谢、氧化胁迫、氮代谢、细胞代谢等。实时荧光定量PCR实验表明芯片实验结果是可靠和可重复的。4.以芯片实验基因筛选结果为参考,应用RCAE技术扩增出与水稻中非酵解型蛋白激酶基因SAPK3同源性极高的甘蔗基因全长cDNA并命名为SoSnRK2.1。序列分析表明,该基因全长cDNA为1385bp,开放阅读框长为1002bp,编码333个氨基酸,并与其它物种SnRK2基因具有很高同源性,聚类分析显示该基因属于SnRK2家族第一亚家族。预测SoSnRK2.1分子量为37.8kDa,等电点为5.54,是亲水性非跨膜蛋白质,在第5-261位氨基酸之间存在蛋白激酶保守催化域,分别具有11、3和8个潜在丝氨酸、苏氨酸、络氨酸磷酸化位点,二级结构中以环状结构所占比例最大。实时荧光定量PCR结果显示该基因在甘蔗叶片中受ABA及水分胁迫诱导表达,与ABA含量有着协同增长关系,推测其在叶中起着ABA信号转导作用；根系中不同处理该基因表达整体呈下降趋势,推测与ABA信号转导通路冗余性相关。

全文目录


摘要  4-7
Abstract  7-11
缩写及符号说明  11-16
1 前言  16-30
  1.1 全球农业生产中的水危机  16
  1.2 水分胁迫与植物生理生化调节机制  16-21
    1.2.1 活性氧的产生及清除  16-17
    1.2.2 水分胁迫与光合作用  17-18
    1.2.3 水分胁迫与渗透调节  18-19
    1.2.4 水分胁迫与内源激素调节  19-21
  1.3 外源植物生长调节剂对植物耐胁迫能力的影响  21-22
  1.4 ABA生物合成及其调节  22-24
    1.4.1 早期质体中的反应  23
    1.4.2 玉米黄质的环化裂解  23-24
    1.4.3 胞质中的后期反应  24
  1.5 ABA信号转导  24-26
    1.5.1 GTG1/GTG2介导的ABA信号  24-25
    1.5.2 PYR/PYL/RCAR介导的ABA信号  25-26
    1.5.3 ABAR/CHLH的ABA信号转导  26
  1.6 ABA与基因转录调控  26-27
  1.7 基因芯片在筛选差异表达基因中的应用  27-28
  1.8 甘蔗抗旱研究进展  28
  1.9 本研究的立论依据及意义  28-30
2 水分胁迫下外源ABA对甘蔗生理生化作用的影响  30-41
  2.1 材料和方法  30-33
    2.1.1 试验品种与处理  30-31
    2.1.2 测定项目和方法  31-33
      2.1.2.1 内源激素含量测定  31
      2.1.2.2 叶片相对含水量测定  31
      2.1.2.3 丙二醛和脯氨酸含量测定  31-32
      2.1.2.4 可溶性蛋白含量测定  32
      2.1.2.5 叶绿素荧光参数测定  32
      2.1.2.6 H_2O_2含量的测定  32
      2.1.2.7 抗氧化酶活性测定  32-33
    2.1.3 数据计算及处理  33
  2.2 结果与分析  33-39
    2.2.1 ABA含量及叶片相对含水量变化  33
    2.2.2 丙二醛含量变化  33
    2.2.3 可溶性蛋白和脯氨酸含量变化  33-35
    2.2.4 IAA和GA含量变化  35-36
    2.2.5 总叶绿素含量和最大量子效率(Fv/Fm)变化  36
    2.2.6 光系统Ⅱ最大光化学效率(Fv'/Fm')变化过程  36-37
    2.2.7 光系统Ⅱ实际量子效率(PS2)变化过程  37
    2.2.8 H_2O_2含量的变化  37-38
    2.2.9 相关抗氧化酶活性的变化  38-39
  2.3 小结  39-41
3 甘蔗SONCED基因克隆及表达分析  41-56
  3.1 材料和方法  42-46
    3.1.1 试验品种与处理  42
    3.1.2 试验试剂  42
    3.1.3 ABA含量测定  42
    3.1.4 O_2~-产生速率测定  42-43
    3.1.5 甘蔗总RNA提取及检测  43
    3.1.6 cDNA第一链合成  43-44
    3.1.7 SoNCED片段的获得  44-45
    3.1.8 SoNCED全长的扩增  45
    3.1.9 序列生物信息学分析  45
    3.1.10 实时荧光定量PCR  45-46
  3.2 结果与分析  46-55
    3.2.1 甘蔗总RNA质量检测  46
    3.2.2 SoNCED基因片段克隆  46
    3.2.3 SoNCED基因全长克隆  46-49
    3.2.4 序列生物信息学分析  49-52
    3.2.5 O_2~-产生速率变化  52-53
    3.2.6 不同处理对SoNCED基因表达及ABA含量的影响  53-55
  3.3 小结  55-56
4 水分胁迫及外施ABA条件下甘蔗基因差异表达谱分析  56-76
  4.1 材料和方法  56-61
    4.1.1 试验品种与处理  56
    4.1.2 基因芯片规格  56
    4.1.3 主要仪器和试剂  56-57
    4.1.4 甘蔗总RNA提取  57
    4.1.5 总RNA的纯化  57-58
    4.1.6 cDNA第一和第二链一步法合成  58
    4.1.7 aaUTP标记的cRNA合成  58-59
    4.1.8 cRNA纯化  59
    4.1.9 cRNA浓度测定  59
    4.1.10 cRNA样品荧光标记  59
    4.1.11 荧光标记cRNA样品纯化  59
    4.1.12 荧光分子浓度及掺入率计算  59
    4.1.13 cRNA样品片段化和芯片杂交  59-60
    4.1.14 芯片洗涤  60
    4.1.15 芯片扫描  60
    4.1.16 数据均一化和基因筛选  60
    4.1.17 芯片的qRT-PCR验证  60-61
  4.2 结果与分析  61-75
    4.2.1 差异表达基因数量分析  61
    4.2.2 ABA诱导基因筛选  61-62
    4.2.3 基因功能注释结果  62-73
    4.2.4 基因功能分类结果  73-74
    4.2.5 qRT-PCR验证结果  74-75
  4.3 小结  75-76
5 甘蔗ABA信号转导SNRK2基因克隆及表达分析  76-86
  5.1 材料与方法  76-78
    5.1.1 试验品种与处理  76
    5.1.2 试验试剂  76-77
    5.1.3 ABA含量测定  77
    5.1.4 甘蔗总RNA提取  77
    5.1.5 cDNA第一链的合成  77
    5.1.6 基因全长克隆  77
    5.1.7 序列生物信息学分析  77
    5.1.8 实时荧光定量PCR  77-78
  5.2 结果与分析  78-85
    5.2.1 SoSnRK2.1序列分析  78-80
    5.2.2 序列生物信息学分析  80-81
    5.2.3 蛋白同源比对及聚类  81-82
    5.2.4 ABA含量变化分析  82-83
    5.2.5 SoSnRK2.1表达分析  83-85
  5.3 小结  85-86
6 讨论与结论  86-96
  6.1 全文讨论  86-93
  6.2 全文结论  93-94
  6.3 论文创新点  94
  6.4 问题与展望  94-96
致谢  96-97
参考文献  97-127
附录  127

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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 经济作物 > 糖料作物 > 甘蔗
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