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棕色棉响应低温胁迫差异表达基因的MSAP及cDNA-AFLP分析

作　者: 卫珺
导　师: 林毅
学　校: 安徽农业大学
专　业: 遗传学
关键词: 棕色棉 低温胁迫 MSAP cDNA-AFLP 甲基化 基因差异表达 半定量RT-PCR
分类号: S562
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


棉花是喜温作物，低温是棉花生产的主要逆境因子。本试验以棕色棉品系棕彩选1号为材料，4℃低温处理棉苗，采用MSAP、cDNA-AFLP和半定量RT-PCR技术，对低温胁迫前后基因表达的差异进行分析，以期筛选出低温胁迫响应基因，为进一步明确棕色棉响应低温胁迫的分子机制提供参考依据。并通过测定三种抗氧化酶（SOD、CAT、POD）活性的变化以及MDA、脯氨酸含量的积累，研究低温胁迫对棉花幼苗生理代谢的影响，探讨棕色棉低温胁迫响应基因对其生理代谢的调节，为棕色棉的抗寒育种工作提供理论基础。主要研究结果如下：(1)采用66对引物组合进行MSAP扩增，发现经低温处理后，DNA甲基化的水平和模式发生了改变。对其中29个多态性片段进行了克隆、测序和序列分析。结果表明：有11条片段(Seq1、Seq2、Seq4、Seq11、Seq15、Seq18、Seq19、Seq21、Seq23、Seq26、Seq27)与已知的棉花相关序列同源性较高，功能涉及启动子、转录因子、干旱胁迫响应基因和纤维素合成酶等。(2)对获得的4个非生物胁迫响应基因GhARM、GhARK、GhCSLD和GhTPS进行半定量RT-PCR分析，发现低温胁迫降低了GhARM、GhARK和GhCSLD的表达，而使GhTPS的表达增强。(3)采用64对引物组合进行cDNA-AFLP扩增，共获得2321个条带，从中得到34条表达存在差异的条带。根据表达模式的不同，对其中表达存在差异的22个TDFs进行了克隆、测序和序列分析。结果表明：在低温胁迫条件下获得的18条TDFs中，上调表达2条（11%），下调表达9条（50%），另外7条（39%）为瞬时表达；而在恢复2d后得到了4条特异表达的TDFs。22个TDFs中，21个TDFs与NCBI中已知功能基因存在同源性，这些基因包括假定蛋白、转座子、线粒体、过氧化物酶体增殖物激活受体和逆境胁迫响应基因等。另有1个TDFs无同源序列。(4)经MSAP和cDNA-AFLP分析发现，有10个序列是属于氧化还原代谢酶类（Seq3、Seq5、Seq7、Seq9、Seq10、Seq13、Seq16、Seq17、Seq29、Seq49)，它们可能与活性氧的清除、H2O2信号转导和代谢相关。另外，分离得到的Seq2和Seq4是干旱诱导蛋白，可能与细胞渗透势调节有关。它们的特异性表达诱导了抗氧化酶（SOD、CAT、POD）活性和脯氨酸含量的提高以及MDA含量的降低。

全文目录


摘要  3-4
Abstract  4-9
1 文献综述  9-14
  1.1 植物低温胁迫响应机理  9
    1.1.1 低温信号转录因子的表达  9
    1.1.2 低温诱导蛋白的产生  9
  1.2 DNA甲基化研究进展  9-10
    1.2.1 DNA甲基化概述  9-10
    1.2.2 DNA甲基化在植物生长过程中的作用  10
    1.2.3 DNA甲基化与低温的进展  10
  1.3 棉花抗寒机理研究进展  10-11
  1.4 MSAP技术及其应用  11-12
    1.4.1 MSAP技术的原理  11
    1.4.2 MSAP技术的特点  11-12
    1.4.3 MSAP技术的应用  12
  1.5 cDNA-AFLP技术及其应用  12-14
    1.5.1 cDNA-AFLP技术的原理  12
    1.5.2 cDNA-AFLP技术的特点  12
    1.5.3 cDNA-AFLP技术的应用  12-14
2 引言  14-16
  2.1 研究目的与意义  14
  2.2 研究内容  14-15
  2.3 技术路线  15-16
3 材料与方法  16-25
  3.1 试验材料与处理  16
  3.2 试验所用引物  16-17
    3.2.1 MSAP分析引物  16-17
    3.2.2 cDNA-AFLP分析引物  17
  3.3 仪器和试剂  17-18
    3.3.1 主要仪器  17
    3.3.2 主要试剂  17-18
  3.4 MSAP分析  18-20
    3.4.1 DNA的提取及检测  18
    3.4.2 MSAP体系的建立  18-19
    3.4.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染  19
    3.4.4 MSAP差异片段的回收与克隆测序  19
    3.4.5 生物信息学分析  19
    3.4.6 非生物胁迫响应基因的半定量RT-PCR分析  19-20
  3.5 cDNA-AFLP分析  20-23
    3.5.1 总RNA的提取及检测  20-21
    3.5.2 双链cDNA的合成  21-22
    3.5.3 cDNA-AFLP体系的建立  22
    3.5.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染  22
    3.5.5 cDNA-AFLP差异片段的回收与克隆测序  22-23
    3.5.6 生物信息学分析  23
  3.6 生理指标的测定  23-25
    3.6.1 抗氧化酶活性的测定  23
    3.6.2 丙二醛含量的测定  23-24
    3.6.3 脯氨酸含量的测定  24-25
4 结果与分析  25-41
  4.1 低温胁迫对棕色棉叶片形态的影响  25
  4.2 棕色棉响应低温胁迫的MSAP分析  25-32
    4.2.1 低温胁迫过程中棕色棉DNA甲基化水平的变化  25-27
    4.2.2 低温胁迫过程中棕色棉DNA甲基化模式的变化  27-29
    4.2.3 MSAP差异表达片段的分析及功能预测  29-32
    4.2.4 非生物胁迫响应基因的半定量RT-PCR分析  32
  4.3 棕色棉响应低温胁迫的cDNA-AFLP分析  32-38
    4.3.1 总RNA电泳检测  32-33
    4.3.2 cDNA-AFLP扩增结果  33-35
    4.3.3 cDNA-AFLP差异表达片段的分析及功能预测  35-38
  4.4 棕色棉响应低温胁迫生理指标的变化  38-41
    4.4.1 低温胁迫对棕色棉抗氧化酶活性的影响  38-40
    4.4.2 低温胁迫对棕色棉丙二醛含量的影响  40
    4.4.3 低温胁迫对棕色棉脯氨酸含量的影响  40-41
5 讨论  41-44
  5.1 MSAP差异分析  41-42
  5.2 cDNA-AFLP差异分析  42-44
6 结论  44-45
参考文献  45-48
附录  48-55
致谢  55-56
作者简介  56
在读期间发表的论文  56

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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 经济作物 > 纤维作物 > 棉
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