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西瓜噬酸菌致病相关基因pilN与pdxJ的功能分析

作　者: 王健超
导　师: 胡白石
学　校: 南京农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 西瓜噬酸菌致病性 pilN pdxJ Ⅳ型菌毛维生素B6
分类号: S436.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

瓜类细菌性果斑病是世界范围内严重危害葫芦科植物的一种细菌性病害,其病原为西瓜噬酸菌(Acidovorax citrulli)。迄今,对该病害的研究主要集中在病原菌鉴定、病原菌检测技术、病害防治方法、品种抗病性鉴定等方面,而对病原菌的致病机理仍然知之甚少,目前所有针对该病害的防治方法只是减轻危害但并不能完全控制该病害。本试验以xjl12菌株为背景构建转座子(mini-Tn5)插入的突变体文库,通过浸种处理和子叶注射接种方法筛选到4株致病力降低明显的突变株,通过亚克隆鉴定其中两株突变体Δxj-7、Δxj-25的Mini-Tn5插入位点分别为pilN、pdxJ基因。其中pilN基因是一种Ⅳ型菌毛组装蛋白家族(fimbrial assembly family protein)的重要基因,其功能主要与菌毛(Pili)的生物合成相关。而pdxJ基因为合成吡哆醛磷酸(pyridoxal phosphate biosynthetic protein)的关键基因,直接影响到维生素B6的生物合成。在西瓜噬酸菌的全基因组中,pdx家族包含有另外一个与pdxJ序列完全相同的基因pdxA。随后利用同源重组的原理分别构建pilN, pdxJ基因插入突变体,并对所得突变体ΔpilNac、ΔpdxJ、野生型以及互补子等多个菌株进行了致病性、过敏性反应、游动性等相关表型进行测定,从分子遗传学的角度说明其致病机制。表型测定结果表明,突变菌株ApilNac相较于野生型,其致病性、游动性、胞外纤维素酶活性降低,同时丧失烟草过敏性反应。qRT-PCR试验结果显示,Ⅲ型分泌系统的主要调控基因以及纤维素酶生物合成基因在ΔpilNac中的转录水平明显下调。证明pilN基因在与一些植物表面的粘附力、定殖能力、生物膜的形成能力等方面发挥了重要作用,并且对细菌Ⅲ型分泌通路也有明显影响,表明Ⅳ型菌毛的生物合成与致病性紧密相关。另一突变菌株ApdxJ的致病性同样显著下降,生长能力、游动性明显降低,无法正常形成生物膜和鞭毛。通过外源添加VB6可恢复其生长能力等部分表型。说明当pdxJ基因破坏后,细菌的生长能力受到抑制,无法正常形成致病相关因子,从而导致其致病力丧失,进一步证明了吡哆醛磷酸(俗称VB6)与果斑病菌的致病性密切相关。

全文目录

摘要  6-7
ABSTRACT  7-9
上篇文献综述  9-30
  第一章瓜类细菌性果斑病的研究现状  10-18
    1 国内外病害发生历史  10
    2 危害  10-11
    3 病原物鉴定  11
    4 侵染途径  11-12
    5 病原菌检测技术  12
    6 防治对策  12
    7 抗病品种研究  12-13
    8 致病机理研究  13-18
      8.1 鞭毛  13
      8.2 Ⅱ型分泌系统  13
      8.3 Ⅲ型分泌系统  13-14
      8.4 Ⅳ型菌毛  14-15
      8.5 群体感应系统  15
      8.6 其它致病相关基因研究  15-18
  第二章维生素B6研究概述  18-28
    1 VB6在生物体内的作用  18
    2 VB6的生理功能  18
    3 PLP在生物体内的代谢反应  18-19
    4 已知的维生素B6合成代谢途径  19-20
    5 细胞中PLP补救合成途径及VB6化合物间的相互转变  20-21
    6 VB6其它的分解代谢途径  21-23
    7 原核和物和真核生物中VB6的分配  23-24
    8 VB6在应激反应中的作用  24-26
    9 PLK酶与维生素B6  26
    10 PNPO酶与维生素B6  26-28
  第三章细菌菌毛的研究现状  28-30
下篇研究内容  30-61
  第一章西瓜噬酸菌pilN基因功能分析  31-49
    摘要  31
    ABSTRACT  31-33
    1 材料与方法  33-42
      1.1 材料  33-34
      1.2 方法  34-42
    2 结果和分析  42-46
      2.1 基因突变体及互补菌株的获得  42-43
      2.2 pilN基因的突变影响睡酸菌的致病性  43
      2.3 pilN基因的突变不能引发烟草过敏性坏死（HR)反应  43-44
      2.4 pilN基因的突变影响臨酸菌的正常生长  44
      2.5 pilN/基因的突变影响臨酸菌的游动性  44-45
      2.6 pilN基因的突变影响Pi酸菌的胞外纤维素酶活力  45
      2.7 pilN基因的突变影响嗟酸菌的生物膜形成能力  45
      2.8 pilN基因的突变影响III型分泌系统相关基因及纤维素酶生物合成基因的表达  45-46
    3 讨论  46-49
  第二章西瓜噬酸菌VB6营养缺陷型与致病性相关  49-61
    摘要  49
    ABSTRACT  49-50
    1 材料与方法  50-54
      1.1 材料  50-52
      1.2 方法  52-54
    2 结果和分析  54-58
      2.1 基因突变体及互补菌株的获得  54
      2.2 pdxJ基因的突变影响臨酸菌的致病性  54-55
      2.3 pdxJ基因的突变影响嗟酸菌在植物体内的定殖能力  55-56
      2.4 pdxJ基因的突变不影响激发烟草过敏性反应的能力  56
      2.5 基因的突变影响臨酸菌的正常生长，外源添加VB6合成途径中的相关代谢产物能够恢复突变体的生长能力  56-57
      2.6 基因的突变影响臨酸菌的游动性，但并不影响其胞外纤维素酶和蛋白酶的活力  57
      2.7 pdxJ基因的突变影响睡酸菌的生物膜形成能力  57-58
    3 讨论  58-61
参考文献  61-77
致谢  77

西瓜噬酸菌致病相关基因pilN与pdxJ的功能分析

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