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马铃薯干腐病和黑痣病菌拮抗芽孢杆菌的筛选及芽孢杆菌遗传多样性研究

作　者: 王爱军
导　师: 李金花
学　校: 甘肃农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 马铃薯 干腐病 黑痣病 拮抗芽孢杆菌 筛选 扩增片段长度多态性
分类号: S435.32
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


本研究从甘肃国营条山农场马铃薯连作试验田的96个小区以五点取样法采集耕作层土样，分离筛选对马铃薯干腐病和黑痣病菌有拮抗作用的芽孢杆菌菌株，采用AFLP技术对部分芽孢杆菌菌株的遗传多样性进行了研究，共取得以下研究成果：1．稀释平板法在LB培养基上共分离得到625株芽孢杆菌（Bacillus spp.）菌株；统计分析表明，马铃薯连作田土壤中总芽孢杆菌的数量正茬＞连作2年＞连作4年，但连作6年的土壤中总芽孢杆菌的数量又有上升的趋势。2．以马铃薯干腐病菌接骨木镰刀菌（Fusarium sambucinum）菌株FSM、茄病镰刀菌（F. solani）菌株FSI和黑痣病菌立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）菌株RS1和菌株RS2为靶标病原菌，平板对峙培养法筛选有抑菌效果的拮抗芽孢杆菌，分析发现抑菌带宽度大于2mm的拮抗芽孢杆菌的数量随连作年限的增加而减少。3．以筛选出的10株同时拮抗4株靶标病原菌的芽孢杆菌菌株为测试菌株，检测其对马铃薯块茎的有无致腐作用，结果表明D1-0-1和D1-0-2两株拮抗芽孢杆菌菌株不引起马铃薯块茎的腐烂。以形态学特征、生理生化特性为基础，结合gyrB基因序列分析，将菌株D1-0-1和D1-0-2鉴定为萎缩芽孢杆菌（B. atrophaeus），为甘肃芽孢杆菌新记录种。4．采用扩增片段长度多态性（AFLP）技术，按照抑菌带宽度从大到小的顺序选出38株对马铃薯镰刀菌干腐病优势病原菌接骨木镰刀菌（F. sambucinum）FSM菌株、茄病镰刀菌（F. solani）FSI菌株与马铃薯黑痣病菌立枯丝核菌（R. solani）RS1和RS2菌株有拮抗作用与10株对4株靶标病原菌均没有拮抗作用的芽孢杆菌，共计48株芽孢杆菌菌株进行遗传多样性分析，采用试剂盒法提取基因组DNA、EcoRⅠ和MseⅠ同步双酶切，从16对引物中筛选出2对引物组合（E-A/M-T、E-C/M-G）能扩增出清晰、稳定且多态性高的条带。引物对E-C/M-G作用下的芽孢杆菌菌株的AFLP图谱条带数多，图谱中的条带分布比较分散，利于条带的统计和数据整理。5．两对引物组合（E-C/M-G和E-A/M-T）共得到扩增位点97个，其中多态性位点达87个，多态性比率为89.69%。聚类分析结果表明，以相似系数0.595为标准时，可将该48株芽孢杆菌菌株分为6个类群，表明在分子水平上拮抗作用不同的芽孢杆菌种间存在较丰富的遗传多样性。6．分析拮抗作用不同的芽孢杆菌树状图发现，芽孢杆菌菌株聚类类群与它的抑菌类型以及菌株来源相关性不大，但与其对4株靶标病原菌的拮抗能力具有一定的相关性。

全文目录


摘要  2-4
Summary  4-8
第一章 文献综述  8-20
  1 马铃薯干腐病与黑痣病及其防治现状  8
  2 芽孢杆菌在植物病害生物防治中的应用  8-10
  3 芽孢杆菌生防作用机制研究  10-12
    3.1 拮抗作用  10-11
    3.2 竞争作用  11
    3.3 促生作用  11-12
    3.4 溶菌作用  12
    3.5 诱导抗性  12
  4 芽孢杆菌种的鉴定  12-13
  5 芽孢杆菌的分子生物学研究  13-15
    5.1 RFLP 分析  13-14
    5.2 RAPD 分析  14
    5.3 SNP 分析  14
    5.4 ISSR 分析  14-15
  6 AFLP 技术  15-18
    6.1 AFLP 分子标记技术的概念  15
    6.2 AFLP 分子标记技术的原理  15
    6.3 AFLP 分子标记技术的优点  15-16
    6.4 AFLP 分子标记技术流程  16
    6.5 AFLP 分子标记技术的应用  16-18
  7 本研究的目的和意义  18-20
第二章 马铃薯干腐病和黑痣病拮抗芽孢杆菌的筛选及鉴定  20-37
  1 材料与方法  21-27
    1.1 土样采集  21
    1.2 供试靶标病原菌  21
    1.3 供试培养基  21-22
    1.4 芽孢杆菌的分离纯化  22
    1.5 拮抗芽孢杆菌菌株的筛选  22
    1.6 拮抗芽孢杆菌菌株对马铃薯块茎安全性的研究  22-23
    1.7 拮抗菌株的鉴定  23-27
  2 结果与分析  27-35
    2.1 不同马铃薯连作处理中土壤芽孢杆菌数量的变化  27
    2.2 马铃薯不同连作处理中拮抗靶标菌的芽孢杆菌菌株的数量变化  27-28
    2.3 芽孢杆菌对不同病原菌拮抗效果的划分及数量分布  28-29
    2.4 对靶标菌均有拮抗作用的 10 株芽孢杆菌菌株的拮抗效果  29-30
    2.5 拮抗芽孢杆菌菌株对马铃薯块茎的影响  30-31
    2.6 拮抗芽孢杆菌菌株 D1-0-1 与 D1-0-2 的培养特性和形态学特征  31
    2.7 拮抗芽孢杆菌菌株 D1-0-1 与 D1-0-2 的生理生化特征测定结果  31-33
    2.8 拮抗芽孢杆菌菌株 D1-0-1 和菌株 D1-0-2 的 gyrB 序列分析  33-35
  3 讨论  35-37
第三章 不同拮抗效果芽孢杆菌遗传多样性分析  37-60
  1 材料与方法  38-44
    1.1 供试菌株及来源  38
    1.2 试验试剂及仪器  38
    1.3 试验方法  38-44
    1.4 电泳结果聚类分析  44
  2 结果与分析  44-58
    2.1 芽孢杆菌基因组 DNA 的提取  44-45
    2.2 基于 EcoRⅠ/MseⅠ双酶酶切效果  45-46
    2.3 预扩增反应  46-47
    2.4 选择性扩增反应  47-48
    2.5 基于 AFLP 分析技术的芽孢杆菌遗传多样性分析  48-57
    2.6 芽孢杆菌基于 AFLP 分析的多态性与抑菌类型的相关性分析  57
    2.7 芽孢杆菌基于 AFLP 分析的多态性与菌株来源的相关性分析  57
    2.8 芽孢杆菌基于 AFLP 分析的多态性与抑菌能力的相关性分析  57-58
  3 讨论  58-60
第四章 主要结论与创新点  60-62
  1 主要结论  60-61
  2 创新点  61-62
参考文献  62-71
致谢  71-72
作者简介  72-73
导师简介  73-74

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 病虫害及其防治 > 农作物病虫害及其防治 > 薯类作物病虫害 > 马铃薯（土豆）病虫害
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