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辣椒素对大鼠DRG神经元VGCCs的抑制作用及其抑制通路的研究

作　者: 解敏
导　师: 王烈成
学　校: 安徽医科大学
专　业: 生理学
关键词: 辣椒素 辣椒素受体 背根神经节 电压门控性钙通道 蛋白激酶C
分类号: R285
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


目的感觉神经元的电压门控性钙通道(voltage-gated calcium channels, VGCCs)在痛觉信号的传递过程中起重要作用,有研究表明,辣椒素能抑制VGCCs,并使伤害性感受器脱敏。本研究应用膜片钳和钙离子成像技术研究辣椒素(capsaicin, Cap)对急性分离的大鼠背根神经节(dorsal root ganglion, DRG)神经元VGCCs的抑制效应并探讨其细胞信号的转导途径。方法1. DRG神经元的分离雄性SD大鼠,体重80~120 g,清洁级。断头处死,取胸段脊柱,置于混合气(95%O2 + 5%CO2)饱和的0℃的DMEM液中,纵向剪开椎管,分离DRG,并随即将其置于含胰蛋白酶(0.5 mg/ml, I型)和胶原酶(1 mg/ml, IA型)的DMEM液中,在恒温水浴(37℃)中消化30分钟。消化完毕,用DMEM液反复清洗四次,然后用不同口径的吸管吹打,使DRG神经元分散成单个细胞形成细胞悬液,用吸管吸取细胞悬液滴在小玻片上静置30分钟,待细胞贴壁后加细胞外液于培养皿中,放置于4℃冰箱,在6小时内可用于实验。2.钙离子成像钙离子成像技术可监测细胞内游离Ca2+浓度([Ca2+]i)的变化。[Ca2+]i的测量采用一种Ca2+敏感性的荧光染料Fura-2 acetoxymethyl ester (Fura-2/AM)。在37℃用含有2μmol/L的Fura-2/AM的外液孵育DRG神经元30 min,结合Ca2+的Fura-2/AM的激发光波长是340 nm,未结合Ca2+的Fura-2/AM的激发光波长是380 nm,发射波长均为510 nm。这样就可以用340 nm和380 nm这两个荧光的比值定量[Ca2+]i的变化。利用钙离子成像分析软件TILLvision软件,可实时检测[Ca2+]i的变化。3.全细胞膜片钳记录VGCC电流以及辣椒素诱导的电流通过膜片钳技术记录。钳制电极由微电极拉制仪拉制而成,然后经抛光仪对电极尖端抛光。在电极充灌内液后,使电极尖端的入水电阻为3至5 M?。使电极与细胞膜达到109 ?(G?)的髙阻抗封接,然后将电极尖端钳制的膜吸破,则全细胞模式建立。将膜电位钳制在?70 mV,用去极化脉冲(0 mV,200 ms)诱发VGCC电流。用辣椒素(1μmol/L)灌流神经元,通过观测辣椒素是否引起DRG神经元产生内向电流检测该神经元对辣椒素的敏感性。膜片钳实验在室温下进行。4.统计学分析采用Igor Pro软件(美国)进行统计分析。统计数据用均数±标准误(mean±SEM)表示,组间均数比较用非配对t检验,p < 0.05认为差异有显著性。结果1.在辣椒素敏感性DRG神经元,给予辣椒素(1μmol/L)可以引起细胞产生内向阳离子电流(辣椒素电流),可通透Ca2+,可以引发胞内游离Ca2+浓度瞬时升高。在辣椒素不敏感的DRG神经元,给予辣椒素(1μmol/L)不能引起细胞产生任何电流效应和细胞内游离Ca2+浓度瞬时升高。2.在辣椒素敏感性DRG神经元,辣椒素(1μmol/L)能可逆地抑制VGCC电流和抑制由高钾(40 mmol/L)介导的电压门控性Ca2+内流。辣椒素抑制VGCCs的效应依赖于胞内Ca2+浓度显著升高。而在辣椒素不敏感的DRG神经元,辣椒素对VGCC电流及其介导的Ca2+内流无明显的抑制作用。3.辣椒素对VGCCs的抑制效应可被蛋白激酶C(PKC)选择性抑制剂Bisindolylmaleimide显著性减弱,而蛋白激酶A(PKA)选择性抑制剂H-89对此抑制效应无显著性影响。提示PKC参与了辣椒素对VGCCs的抑制。结论在辣椒素敏感性的DRG神经元,辣椒素对VGCCs具有抑制作用,这种抑制作用途径是通过升高细胞内游离Ca2+和和PKC水平来实现的。

全文目录


研究论文 辣椒素对大鼠 DRG 神经元 VGCCs 的抑制作用及其抑制通路的研究  5-44
  英文缩略词表  5-6
  中文摘要  6-8
  英文摘要  8-11
  1 前言  11-13
  2 材料与方法  13-17
  3 结果  17-28
  4 讨论  28-33
  5 结论  33-34
  6 参考文献  34-41
  附录 简历  41-43
  致谢  43-44
综述 电压门控性钙通道与痛觉  44-59
  1 VGCCs的分类及结构  44-46
  2 疼痛的分期及其特点  46
  3 几种亚型的 VGCCs 和疼痛  46-51
  4 结语  51-52
  5 参考文献  52-59
Voltage-gated Calcium Channels and Pain  59

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