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干酪乳杆菌冷冻干燥保护剂筛选及作用机理研究

作　者: 王琳
导　师: 赵征
学　校: 天津科技大学
专　业: 农产品加工及贮藏工程
关键词: 冷冻干燥保护剂作用机理
分类号: TS252.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

真空冷冻干燥是生产商品化乳酸菌发酵剂的常用技术,但是冷冻干燥过程易造成乳酸菌细胞的损伤、死亡及胞内某些酶蛋白分子钝化,表现为存活率降低、细胞活性和酶活力下降等。冻干之前添加适宜的保护剂是行之有效的保护措施,然而冷冻干燥保护剂种类繁多,作用效果也因菌种而异。目前国内关于乳酸菌冷冻干燥的研究主要集中在筛选保护剂上,从细胞水平解释保护剂作用机理的研究则相对较少。本论文以干酪乳杆菌为研究对象,主要研究冻干保护剂的筛选和优化；冻干前后乳酸菌存活率、复苏能力和产酸活力的变化,比较保护剂的作用效果；通过检测不同保护剂作用下冷冻干燥过程中细胞膜完整性的变化、细胞膜氧化程度和胞内关键酶活性变化情况,探究冻干保护剂的作用机理。以冷冻干燥后干酪乳杆菌的存活率为指标,通过响应面方法优化了冷冻干燥保护剂配方,即脱脂乳、乳糖和谷氨酸钠的质量浓度分别为15.8g/100mL、5.73g/100mL和0.42g/100mL时,冻干后干酪乳杆菌具有最大存活率为92.4%。在不添加保护剂情况下,冻干后细胞存活率仅为5.25%,复苏时间(tOD0.2)长达90min, tpH5.5为20h。添加保护剂后,上述指标均有不同程度的改善,其中复配保护剂的保护效果优于单一保护剂,冻干保护效果依次为复配>脱脂乳>乳糖>谷氨酸钠。在复配保护剂中冻干的干酪乳杆菌存活率为92.4%,复苏时间20min, tpH5.5为10h。通过PI/5(6)-CFDA双染色使用流式细胞仪研究不同保护剂作用下冻于前后细胞膜完整性的变化情况。结果表明,谷氨酸钠、乳糖和脱脂乳可以减缓冰晶对细胞膜造成的“机械损伤”。利用C11-BODIPY581/591作为探针,精确检测出了不同保护剂作用下冷冻干燥后细胞膜脂质过氧化的情况。结果表明,谷氨酸钠和乳糖具有清除部分自由基的能力,而对相应处理的细胞存活率分析显示：冷冻干燥过程中,自由基对干酪乳杆菌细胞膜的攻击并不是导致细胞死亡的主要原因。另外,谷氨酸钠、乳糖和脱脂乳还可以缓解“溶质效应”对胞内酶的损伤。在保护剂作用下,胞内非特异性酯酶、β-半乳糖苷酶和ATP酶的活性与不添加保护剂冻干后相比,均有不同程度的提高。

全文目录

摘要  4-5
ABSTRACT  5-8
1 前言  8-18
  1.1 益生菌与干酪乳杆菌简介  8-10
    1.1.1 益生菌  8-9
    1.1.2 干酪乳杆菌  9-10
  1.2 冷冻干燥概述  10-13
    1.2.1 冷冻干燥原理  10
    1.2.2 冷冻干燥过程  10-11
    1.2.3 冷冻干燥对微生物的影响  11-13
  1.3 冻干保护剂  13-14
    1.3.1 保护剂的要求  13
    1.3.2 保护剂的分类  13
    1.3.3 保护剂的作用  13-14
  1.4 国内外研究现状  14-16
    1.4.1 干酪乳杆菌冻干保护剂的研究  15
    1.4.2 保护剂作用机理的研究  15-16
  1.5 研究背景及意义  16
  1.6 研究内容  16-18
2 材料与方法  18-25
  2.1 实验材料  18-19
    2.1.1 菌种  18
    2.1.2 培养基  18
    2.1.3 化学试剂  18-19
  2.2 实验方法  19-20
    2.2.1 活菌计数  19
    2.2.2 生长曲线的测定  19-20
    2.2.3 菌体的冷冻干燥  20
  2.3 研究内容  20-25
    2.3.1 保护剂的筛选及优化  20-21
    2.3.2 冻干保护剂的作用效果  21
    2.3.3 保护剂的作用机理  21-25
3 结果与讨论  25-55
  3.1 收获期的确定  25-26
  3.2 冻干保护剂的筛选与优化  26-32
    3.2.1 Plackett-Burman 实验  26-27
    3.2.2 一阶拟合实验  27-28
    3.2.3 最速上升实验  28-29
    3.2.4 中心复合实验及结果  29-32
  3.3 保护剂的作用效果  32-35
    3.3.1 保护剂对干酪乳杆菌冻干存活率的影响  33-34
    3.3.2 保护剂对干酪乳杆菌复苏能力的影响  34
    3.3.3 保护剂对干酪乳杆菌产酸能力的影响  34-35
  3.4 保护剂的保护机理  35-55
    3.4.1 保护剂对干酪乳杆菌细胞膜完整性的影响  35-48
    3.4.2 保护剂对胞内酯酶活性的影响  48-49
    3.4.3 保护剂对细胞膜脂质氧化的影响  49-50
    3.4.4 保护剂对关键酶活性的影响  50-52
    3.4.5 相关性分析  52-55
4 结论  55-57
5 展望  57-58
6 参考文献  58-64
7 攻读硕士学位期间发表论文情况  64-65
8 致谢  65

干酪乳杆菌冷冻干燥保护剂筛选及作用机理研究

内容摘要

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