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微生物絮凝剂HBF-3的剂型研究和vip3Aa基因对淡紫拟青霉的遗传转化

作　者: 赵妮
导　师: 喻子牛
学　校: 华中农业大学
专　业: 微生物学
关键词: 微生物絮凝剂 冷冻干燥 旋转蒸发浓缩 营养期杀虫蛋自 淡紫拟青霉
分类号: Q93
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


本研究主要进行了两个相互独立的工作：1微生物絮凝剂HBF-3的剂型研究絮凝剂HBF-3是由一株深海盐单胞菌V3a’(Halomonas sp. V3a’)产生的一种酸性多糖,具有较好的絮凝活性。为进一步开发利用该生物絮凝剂,本实验进行了剂型研究。以5%蔗糖为保护剂,采用冷冻干燥技术将发酵液制成固体剂型,冻干的HBF-3能够迅速复溶于水,絮凝活性为82.4%,维持了较高的絮凝活性。采用旋转蒸发浓缩,浓缩液稀释后的絮凝活性与初始发酵液相比,变化不大。对液体浓缩型絮凝剂添加1.0g/L山梨酸钾,样品在4℃、28℃、37℃、50℃储存一个月后能够保持90%以上的絮凝活性。2 vip3Aa基因对淡紫拟青霉的遗传转化淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)作为根结线虫(Meloidogyne spp.)、胞囊线虫(Heterodera spp.)等植物病原线虫的有效寄生菌,被认为是最有前途的植物病原线虫的生防真菌之一。Vip3Aa是苏云金芽胞杆菌在营养期开始表达的可溶性蛋白,对甜菜夜蛾和小地老虎具有很高毒力。本研究首次将vip3Aa基因转化到淡紫拟青霉基因组中,以获得既能防治根结线虫又能防治小地老虎等地下害虫的工程菌株。将vip3Aa基因克隆到pET28b(+)载体,并在大肠杆菌中表达,经纯化后得到Vip3Aa蛋白,以此作抗原免疫新西兰兔制备抗Vip3Aa多克隆抗体。分别以pcDNA3.1(-)和pcDNA3.1(+)为中间质粒,构建了vip3Aa基因的遗传转化载体puPVNT并将该质粒转化根癌农杆菌LB4404。以G418抗性基因为筛选标记,采用ATMT(Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation)法实现了vip3Aa基因对淡紫拟青霉9410菌株的遗传转化。PCR检测证实,vip3Aa基因成功整合到淡紫拟青霉9410菌株的基因组中。

全文目录


摘要  7-8
Abstract  8-10
缩略语表  10-11
第一部分 微生物絮凝剂HBF-3的剂型研究  11-28
  1 前言  11-19
    1.1 絮凝剂简述  11-15
    1.2 微生物絮凝剂的研究现状  15-16
    1.3 絮凝剂的后处理工艺  16-18
      1.3.1 冷冻干燥  16-17
      1.3.2 旋转蒸发浓缩  17
      1.3.3 防腐剂储存  17-18
    1.4 本研究的目的和意义  18-19
  2 材料与方法  19-21
    2.1 材料  19
      2.1.1 菌种及培养基  19
      2.1.2 试剂与仪器  19
    2.2 实验方法  19-21
      2.2.1 HBF-3絮凝剂的发酵生产  19
      2.2.2 冷冻干燥  19
      2.2.3 旋转蒸发浓缩  19-20
      2.2.4 絮凝剂的絮凝活性测定  20-21
  3 结果与分析  21-24
    3.1 冷冻干燥后成品活性分析  21
    3.2 旋转蒸发浓缩对絮凝活性的影响  21-22
    3.3 防腐储存  22-24
  4 讨论  24-25
  参考文献  25-28
第二部分 vip3Aa基因对淡紫拟青霉的遗传转化  28-60
  1 前言  28-35
    1.1 作物的线虫及地下害虫的危害及其防治  28-29
    1.2 生防真菌淡紫拟青霉  29-32
      1.2.1 淡紫拟青霉对作物线虫病的生物防治  29-30
      1.2.2 淡紫拟青霉菌剂类型的研究  30-31
      1.2.3 淡紫拟青霉菌作用机理研究  31-32
      1.2.4 淡紫拟青霉菌种改良  32
    1.3 苏云金芽胞杆菌营养期杀虫蛋白Vip3A  32-34
      1.3.1 Vip3A研究现状  32-33
      1.3.2 Vip3A蛋白作用机理研究  33-34
    1.4 本课题的目的和意义  34-35
  2 材料与方法  35-46
    2.1 实验材料  35-39
      2.1.1 菌株与质粒  35-36
      2.1.2 培养基  36-37
      2.1.3 试剂  37
      2.1.4 仪器  37
      2.1.5 溶剂与缓冲溶液  37-39
    2.2 实验方法  39-46
      2.2.1 DNA操作  39
      2.2.2 重组质粒的转化  39-40
      2.2.3 根癌农杆菌介导的淡紫拟青霉遗传转化  40-41
      2.2.4 转化子的Southern blot分析  41-43
      2.2.5 蛋白质SDS-PAGE  43-44
      2.2.6 抗体制备  44
      2.2.7 Western blotting  44
      2.2.8 PCR扩增  44-46
  3 结果与分析  46-57
    3.1 vip3Aa基因的克隆、原核表达和纯化  46-48
      3.1.1 原核表达载体pVIP的构建  46-47
      3.1.2 Vip3Aa蛋白的表达纯化  47-48
    3.2 真菌表达载体puPVNT的构建  48-53
      3.2.1 重组质粒pPVT的构建  48-50
      3.2.2 重组质粒pPNT2的构建  50-52
      3.2.3 重组质粒puPVNT的构建  52-53
    3.3 质粒puPVNT转化农杆菌LB4404  53-54
    3.4 农杆菌介导的遗传转化  54
    3.5 淡紫拟青霉vip3Aa转化子的PCR检测  54-56
    3.6 淡紫拟青霉vip3Aa转化子的Southern-blot分析  56-57
  4 讨论  57-60
参考文献  60-65
致谢  65

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中图分类: > 生物科学 > 微生物学
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