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苦荞多酚及其改善内皮胰岛素抵抗的研究

作　者: 国旭丹
导　师: 王敏
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 食品科学
关键词: 苦荞黄酮酚酸抗氧化胰岛素抵抗
分类号: TS201.4
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

苦荞为国际粮农组织公认的优秀药食兼用作物，其保健功能自中国历代古医书就多有阐述。现代医学研究也证明苦荞具有抗氧化、抗炎、降血糖、降血脂、降血压、抗肿瘤等多种药理活性。专家预测，到2020年全球范围内，在人类历史上心血管疾病（CVD）将首次成为首位的致死原因。CVD的共同病理基础是代谢紊乱。“代谢综合征”（MS）是以胰岛素抵抗（IR）为特征的一类共同发生发展、相互紧密联系的代谢紊乱的总称，它不是一种单一的疾病，而是一系列病理生理现象的统一体，如肥胖、Ⅱ型糖尿病、高血脂、高血压（或冠心病）等，亦称为胰岛素抵抗综合征。胰岛素抵抗实际上是机体长期存在并呈进行性发展的一个亚健康状态，而对防治胰岛素抵抗强调的是早期干预和长期干预，这正符合功能性食品的应用特征。苦荞在食品及医药领域已广受关注，多酚成分是其功能性开发的基础。本研究以苦荞多酚为研究对象，分析苦荞的多酚抗氧化组分的存在形式与影响因素，并采用活性追踪法分离主要抗氧化物质，同步研究苦荞主要抗氧化物质槲皮素及其体内代谢物槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸改善内皮IR活性，明确其在体内代谢转化过程中改善血管内膜IR的活性形式、作用效果与作用机理。本研究将苦荞的功能性推向了一个新的高度。本文以苦荞麦为实验材料，以苦荞黄酮和酚酸为研究对象，将植物化学、现代色谱分析、分子生物学和药理学等学科有机结合，以抗氧化活性为切入点，以自由基、活性物质与功能关系及IR理论为指导，采用HPLC分析、植物化学分离纯化NMR鉴定技术及Elisa和Western blot相结合的研究方法和技术，研究苦荞多酚和抗氧化性的内在和外在影响因素，并活性追踪分离纯化鉴定其主要抗氧化物质，探讨主要抗氧化物质槲皮素及体内代谢物槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸改善IR状态下血管内膜功能的效应及作用机制，以期为苦荞预防代谢综合征提供理论依据。主要研究结果为：（1）苦荞籽的绝大部分（76%-95%）酚物质以游离形式存在，游离酚是其发挥抗氧化性的主要贡献者，游离酚和结合酚的分布研究有利于理解食用苦荞对健康的益处。（2）苦荞籽除富含芦丁外，含有的酚酸包括p-羟基苯甲酸、阿魏酸、原儿茶酸、p-香豆酸、没食子酸、咖啡酸、香草酸、紫丁香酸和绿原酸，其中原儿茶酸和阿魏酸是苦荞籽的主要酚酸。（3）苦荞品种和生长环境及其它们的交互作用影响着苦荞酚物质的含量和抗氧化性。环境参数如高海拔有助于提高苦荞芦丁和酚酸含量。该结果提示通过优化特定苦荞品种的生长条件便能培育出富含天然抗氧化成分的苦荞存在可能。（4）苦荞的酚含量、组成及其抗氧化性受组织结构影响。原儿茶酸是苦荞壳（>40目）的主要酚酸，p-羟基苯甲酸是苦荞麸（40-80目）和细粉（<80目）的主要酚酸。苦荞壳、麸皮、细粉的总酚含量排序为：麸>壳>细粉。清除DPPH自由基和ABTS自由基能力的排序为：麸>壳>细粉。总还原力的排序为：壳>麸>细粉。该结果暗示苦荞籽壳和麸皮，（常被弃去的部分）的多酚等抗氧化功能性物质高于细粉（常被食用部分）。如果将壳和麸皮超微粉碎后添加到其它粮谷食品中，将极大的提高其粮谷食品的功能价值。因此，苦荞壳和麸皮极有潜力作为功能食品原料以提高苦荞的附加值。（5）苦荞麸皮乙醇粗提物乙酸乙酯萃取相的总酚和总黄酮含量及抗氧化性均显著高于正丁醇相和水相，说明乙酸乙酯是富集苦荞黄酮粗提物的良好溶剂。（6）采用活性追踪法分离的苦荞麸皮的主要抗氧化物质为槲皮素、p-羟基苯甲酸和胡萝卜苷，在这三种物质中槲皮素含量最高，p-羟基苯甲酸首次从苦荞样品中分离出来。该结果有助于理解苦荞的保健功能，将会促进苦荞在保健食品和医药领域的利用。（7）在人脐静脉内皮细胞（HUVECs）中，苦荞麸皮主要抗氧化物质槲皮素和其代谢物槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸能显著抑制棕榈酸（PA）引起的活性氧（ROS）的过量产生并能恢复下降的线粒体膜电位，从而表现出抑制氧化应激的活性；能有效抑制PA诱导的IKKβ和NF-κB的激活，降低炎性因子IL-6和TNF-α蛋白的产生，从而表现出针对IKKβ/NF-κB途径的抗炎活性。（8） PA通过炎性反应和氧化应激阻碍了胰岛素在HUVECs内沿PI3K信号通路的转导。而槲皮素和槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸能显著有效抑制PA刺激的IRS-1丝氨酸磷酸化的增加，恢复胰岛素作用下IRS-1酪氨酸磷酸化及PI3K信号下游Akt和eNOS的磷酸化活化，进而促进NO的释放，从而表现出对PI3K/Akt信号通路转导的调控作用，即改善内皮功能紊乱的作用。（9）槲皮素和槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸改善血管内膜IR的信号途径为ROS/IKKβ/IRS-1/PI3K/Akt/eNOS/NO。该结果明确了苦荞对IR状态下血管内膜功能的调节效应、作用特点和关键靶点，勾勒出苦荞干预血管内膜IR的分子机制。该结果提示槲皮素和体内代谢物槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸对IR状态下内皮功能紊乱具有一定的保护作用。本研究同时考察槲皮素和其代谢物对内皮细胞胰岛素敏感性影响的结果为槲皮素预防或治疗与IR有关的内皮功能紊乱提供了有力的理论依据，而且对预防和治疗MS具有重要的理论意义。本研究从活性物质与功能关系和分子信号转导途经方面为苦荞预防或治疗MS提供了强有力的理论依据，并将苦荞的功能性推向了一个新的高度。

全文目录

摘要  6-8
ABSTRACT  8-15
第一章文献综述  15-44
  1.1 多酚类物质研究进展  15-26
    1.1.1 膳食多酚的分类和化学结构  15-20
    1.1.2 膳食多酚的功能  20
    1.1.3 人类膳食中的多酚含量  20-21
    1.1.4 膳食多酚的生物利用率  21-26
  1.2 荞麦属植物研究进展  26-35
    1.2.1 荞麦属植物化学成分  26-33
    1.2.2 苦荞的功能作用  33-35
  1.3 胰岛素抵抗研究进展  35-41
    1.3.1 胰岛素信号通路与胰岛素抵抗  35-38
    1.3.2 胰岛素抵抗的诱因  38-40
    1.3.3 胰岛素抵抗和内皮功能紊乱的关系  40-41
    1.3.4 改善胰岛素抵抗的药物  41
  1.4 本研究的目的及意义  41-42
  1.5 研究内容及技术路线  42-43
    1.5.1 研究内容  42-43
    1.5.2 技术路线  43
  1.6 研究创新点  43-44
第二章苦荞籽多酚成分和抗氧化性的外部影响因素—环境条件  44-59
  2.1 材料与仪器  45
    2.1.1 试验材料  45
    2.1.2 仪器设备  45
  2.2 试验方法  45-47
    2.2.1 苦荞籽游离酚和结合酚的提取  45-46
    2.2.2 总酚含量的测定  46
    2.2.3 总黄酮含量的测定  46
    2.2.4 酚化合物组成的分析  46-47
    2.2.5 抗氧化能力的测定  47
    2.2.6 统计学分析  47
  2.3 结果与分析  47-58
    2.3.1 苦荞籽总酚和总黄酮含量  47-49
    2.3.2 苦荞籽黄酮和酚酸的组成  49-53
    2.3.3 苦荞籽的抗氧化能力  53-55
    2.3.4 品种（V）和环境（E）对苦荞酚含量和抗氧化性的影响  55-57
    2.3.5 苦荞籽抗氧化性间的相关性  57-58
  2.4 小结  58-59
第三章苦荞籽多酚成分和抗氧化性的内部影响因素—组织结构  59-71
  3.1 材料与仪器  59-60
    3.1.1 试验材料  59-60
    3.1.2 仪器设备  60
  3.2 试验方法  60-61
    3.2.1 苦荞籽游离酚和结合酚的提取  60
    3.2.2 总酚含量的测定  60
    3.2.3 总黄酮含量的测定  60
    3.2.4 酚化合物组成的分析  60
    3.2.5 抗氧化能力的测定  60-61
    3.2.6 统计学分析  61
  3.3 结果与分析  61-69
    3.3.1 苦荞不同磨粉部分的总酚含量  61-62
    3.3.2 苦荞不同磨粉部分的总黄酮含量  62-63
    3.3.3 苦荞不同磨粉部分的芦丁和酚酸组成  63-66
    3.3.4 苦荞不同磨粉部分的抗氧化性  66-68
    3.3.5 苦荞不同磨粉部分抗氧化性间的相关性  68-69
  3.4 小结  69-71
第四章苦荞麸乙醇粗提物各极性成分的抗氧化活性  71-79
  4.1 材料与仪器  71-72
    4.1.1 试验材料  71
    4.1.2 仪器设备  71-72
  4.2 试验方法  72-73
    4.2.1 不同溶剂萃取  72
    4.2.2 总酚含量的测定  72
    4.2.3 总黄酮含量的测定  72
    4.2.4 抗氧化能力的测定  72-73
    4.2.5 统计学处理  73
  4.3 结果与分析  73-78
    4.3.1 各萃取相的得率  73
    4.3.2 各萃取相的总酚含量和总黄酮含量测定  73-74
    4.3.3 各萃取相的抗氧化性  74-77
    4.3.4 总酚和总黄酮含量与抗氧化性的关系  77-78
  4.4 讨论  78
  4.5 小结  78-79
第五章苦荞麸乙醇粗提物乙酸乙酯相抗氧化物质的纯化与鉴定  79-91
  5.1 材料与仪器  79
    5.1.1 试验材料  79
    5.1.2 仪器设备  79
  5.2 试验方法  79-80
    5.2.1 HPLC 分析  79-80
    5.2.2 乙酸乙酯相的分离  80
    5.2.3 DPPH 自由基清除能力的测定  80
    5.2.4 Fr.11-Fr.14 部分的 HPLC 部分的分析与柱层析分离  80
    5.2.5 化合物的鉴定  80
  5.3 结果与分析  80-90
    5.3.1 萃取相的 HPLC 分析  80-82
    5.3.2 乙酸乙酯相分离部分的抗氧化性  82-83
    5.3.3 Fr.11-Fr.14 部分的 HPLC 分析  83-86
    5.3.4 化合物的鉴定  86-90
  5.4 小结  90-91
第六章槲皮素和槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸抑制内皮氧化应激与炎性反应  91-105
  6.1 材料与仪器  91-93
    6.1.1 试验材料  91-93
    6.1.2 仪器设备  93
  6.2 试验方法  93-98
    6.2.1 槲皮素和槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸溶液的配制  93-94
    6.2.2 HUVECs 细胞培养  94
    6.2.3 抑制内皮细胞氧化应激的能力  94-95
    6.2.4 抑制内皮细胞炎性反应的能力  95-98
    6.2.5 统计学分析  98
  6.3 结果与分析  98-103
    6.3.1 抑制 HUVECs 中 PA 介导的 ROS 的生成  98-99
    6.3.2 恢复 PA 刺激引起的线粒体膜电位下降  99-100
    6.3.3 抑制 HUVECs 中 PA 刺激引起的 IKKβ的活化  100
    6.3.4 抑制 HUVECs 中 PA 刺激引起的 NF-κB 的活化  100-101
    6.3.5 减少 PA 刺激引起的 IL-6 蛋白质的合成量  101-102
    6.3.6 减少 PA 刺激引起的 TNF-α蛋白质的合成量  102-103
  6.4 讨论  103-104
  6.5 小结  104-105
第七章槲皮素和槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸改善内皮胰岛素抵抗  105-115
  7.1 材料与仪器  105-107
    7.1.1 试验材料  105-106
    7.1.2 仪器设备  106-107
  7.2 试验方法  107-109
    7.2.1 槲皮素和槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸溶液的配制  107
    7.2.2 HUVECs 细胞培养  107
    7.2.3 对胰岛素信号通路转导的影响  107-109
    7.2.4 统计学分析  109
  7.3 结果与分析  109-113
    7.3.1 抑制 PA 引起的 IRS-1 丝氨酸磷酸化  109-110
    7.3.2 恢复 PA 刺激引起的 IRS-1 酪氨酸磷酸化的下降  110
    7.3.3 促进胰岛素介导 HUVECs 中 Akt 的磷酸化  110-111
    7.3.4 促进胰岛素介导 HUVECs 中 eNOS 的磷酸化  111-112
    7.3.5 对 HUVECs 中胰岛素介导的 NO 合成的调节作用  112-113
  7.4 讨论  113-114
  7.5 小结  114-115
第八章讨论与结论  115-120
  8.1 讨论  115-118
  8.2 结论  118-120
参考文献  120-136
附录  136-141
缩略词  141-142
致谢  142-143
作者简介  143

苦荞多酚及其改善内皮胰岛素抵抗的研究

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