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橡胶炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）致病相关突变体表型分析及插入位点定位

作　者: 刘艳
导　师: 郑服丛
学　校: 海南大学
专　业: 分子植物病理学
关键词: 胶孢炭疽菌启动子捕获 ATMT 致病相关突变体 TAIL-PCR 侧翼序列
分类号: S763.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

橡胶树炭疽病（Rubber plant anthracnose）主要是由胶孢炭疽菌[Colletotrichum gloeosporioides （Penz.）Sacc]侵染造成的,是橡胶树重要的叶部病害之一。构建炭疽菌ATMT （Agrobacterium tumefaciens-Mediated Transformation）转化体库,鉴定相关突变体,利用分子生物学技术分离和鉴定橡胶树胶胞炭疽菌的致病相关基因,是了解其致病机理及互作机制的重要手段。不仅在植物病理学上有重要意义,而且也为生产上进一步探索新的防病途径提供线索,为选育持久抗病品种、制定橡胶炭疽病菌持续管理策略等提供理论依据。本研究利用启动子捕获技术通过农杆菌介导的遗传转化体系构建橡胶炭疽病菌RC-178的突变体库,使转化子数目增加到1685个。通过致病力的测定,从该突变体库中筛选到15个致病力明显减弱或丧失的突变体。对这15个突变体进行了生物学特性的观察分析,发现2个颜色异常,6个菌落生长缓慢,8个产孢量显著降低,2个分生孢子形态异常,2个附着胞形态异常,3个不能形成附着胞,在洋葱表皮上侵染钉形成率显著降低。对这15个突变体的基因组DNA进行PCR扩增,结果全部都扩增到潮霉素磷酸转移酶（hph）基因序列,而野生型基因组DNA扩增不到,表明突变体的表型变化是由于外源DNA插入所致。采用TAIL-PCR的方法对这15个突变体基因组DNA进行扩增,得到特异扩增片段,并对这些DNA序列进行克隆和测序,获得3条序列信息,将这些序列在NCBI网站上进行Blast搜索,结果如下：突变体T-0900-1的T-DNA插入位点右边界克隆到1275bp片段,其中950bp-1143bp的134bp与脉孢菌（Neurospora）的一个保守假设蛋白同源性最高,同时966bp-1143bp的113bp与稻瘟菌（Magnaporthe grisea）的70-15保守假设蛋白（MGG₀3680）也具有很高同源性。T-0003-3的T-DNA插入位点右边界克隆到688bp片段,其中1bp-240bp、240bp-301bp的序列与耐热子囊菌（Neosartorya fischeri）、棒状曲霉（Aspergillus fumigatus）真核翻译起始因子3同源性很高。T-1103-2左边界克隆到712bp片段BLAST分析未找到与其同源性较高的基因序列,推测其被破坏的基因是目前在真菌中生物功能尚未确定的基因。

全文目录

摘要  5-6
Abstract  6-8
目录  8-10
1 前言  10-23
  1.1 橡胶炭疽病与炭疽病菌  10-11
  1.2 炭疽菌侵染策略  11-12
  1.3 胶孢炭疽菌的潜伏侵染  12
  1.4 炭疽病致病相关基因的研究  12-14
  1.5 获得T-DNA侧翼序列的研究方法  14-21
    1.5.1 质拉拯救(plasmid rescue)法  14-15
    1.5.2 反向PCR(inverse or inverted PCR,IPCR)法  15-16
    1.5.3 PCR-walking  16
    1.5.4 Sequence-based分离法  16-17
    1.5.5 突变位点扩增法(Amplification ofinsertion mutagenised sites,AIMS)  17
    1.5.6 连接介导PCR(Ligation-mediated PCR,LMPCR)  17-18
    1.5.7 外源接头PCR  18-19
    1.5.8 热不对称文错PCR(Thermal Asymmetric Interlaced PCR,TAIL-PCR)  19-21
  1.6 本研究的目的意义和研究内容  21-23
    1.6.1 目的意义  21-22
    1.6.2 本研究的技术路线  22-23
2 材料与方法  23-37
  2.1 实验材料  23-25
    2.1.1 胶胞炭疽菌  23
    2.1.2 接种材料  23
    2.1.3 菌种和质粒  23-24
    2.1.4 主要酶和生化试剂  24
    2.1.5 引物合成  24
    2.1.6 培养基  24-25
    2.1.7 滤纸片  25
  2.2 方法  25-37
    2.2.1 致病相关突变体的筛选  25-27
    2.2.2 突变体的分子检测  27-29
      2.2.2.1 胶胞炭疽菌基因组DNA的提取及检测  27-28
      2.2.2.2 质粒提取及检测  28-29
      2.2.2.3 T-DNA插入的分子检测  29
    2.2.3 突变体的生物学表型观察  29-30
      2.2.3.1 菌落生长速率测定  29
      2.2.3.2 产孢量测定及孢子形态观察  29-30
      2.2.3.3 孢子萌发和附着胞形成的观察  30
      2.2.3.4 侵染钉形成的观察  30
    2.2.4 致病相关突变体T-DNA插入位点的侧翼序列分析  30-37
      2.2.4.1 TAIL-PCR扩增  30-34
      2.2.4.2 TAIL-PCR扩增产物回收  34
      2.2.4.3 TAIL-PCR产物和载体的连接  34
      2.2.4.4 连接产物转化大肠杆菌  34-35
      2.2.4.5 菌液PCR鉴定  35-36
      2.2.4.6 TALI-PCR产物的测序和分析  36-37
3 结果与分析  37-50
  3.1 T-DNA插入突变转化效率  37
  3.2 致病力相关突变体筛选结果与分析  37-40
    3.2.1 离体叶片接种发病情况  37-38
    3.2.2 疽菌基因组DNA的提取结果  38
    3.2.3 T-DNA的PCR检测结果  38-40
  3.3 致病相关突变体的生物学特性测定  40-45
    3.3.1 菌落形态和颜色观察  40-41
    3.3.2 菌株生长速率的比较  41-42
    3.3.3 突变体产孢量的测定及分生孢子形态观察  42-44
    3.3.4 分生孢子萌发及附着孢、侵染钉形成观察  44-45
  3.4 T-DNA插入位点的侧翼序列扩增和分析  45-50
    3.4.1 TAIL-PCR扩增  45-46
    3.4.2 T-DNA插入位点的侧翼序列的序列分析  46-50
4 结论与讨论  50-53
  4.1 关于遗传转化体系  50
  4.2 关于致病相关突变体的筛选  50-51
  4.3 关于TAIL-PCR  51-52
  4.4 突变体库的保存  52-53
5 问题与展望  53-54
参考文献  54-64
致谢  64-65
附录  65-73
  附录1 部分生物学特性图片  65-68
  附录2 突变体序列比对结果  68-72
  附录3 通用实验材料与方法  72-73
  附录4 主要仪器设备  73

橡胶炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）致病相关突变体表型分析及插入位点定位

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