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中国柑橘炭疽病病原种类及种群遗传多样性研究

作　者: 陈国庆
导　师: 李红叶
学　校: 浙江大学
专　业: 植物病理学
关键词: 柑橘炭疽病 胶孢炭疽菌 尖胞炭疽菌 平头炭疽菌 种群遗传多样性
分类号: S436.66
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


柑橘炭疽病是柑橘上重要的常发性病害,为害新梢、叶片、花器、幼果、果梗以及引起贮藏期蒂腐烂果,某些年份在局部地区会爆发流行带来巨大的经济损失。然而国际上有关柑橘炭疽病的研究并不深入,国内的研究更是屈指可数。本文就我国柑橘炭疽菌属(Colletotrichum spp.)真菌引起的病原种类,以及优势种群的种群遗传多样性开展了研究,获得如下结果。对来自浙江,江西,广东,福建,湖南,重庆和云南等地不同柑橘类型(品种),不同发病器官的炭疽病材料进行分离培养,获得220个单孢菌株。依据在PDA培养基上的培养特征和分生孢子的形态,病菌可分为3个类型,A：菌落颜色白色至深青色,变化多样,生长速率1.2-1.7 cm／天,产生鲜红色分生孢子堆,孢子呈棍棒状,两端钝圆,大小12.5～18.6×4.7～6.0μm；B：菌落灰白色,生长速率0.6～0.8 cm／d,产生淡红色孢子堆,分生孢子梭形,两端尖,12.4-14.8×4.1～5.1μm；C：菌落青色,生长速率居于A,B之间,1.0-1.3 cm／d,产生橘黄色分生孢子堆,分生孢子新月形。测定这3个类型菌株的致病性表明：A和C类型菌株均能侵染椪柑(Citrus reticulata)嫩梢、花器和成熟的果实,引起典型的症状；而B类型菌株只能感染椪柑的花器,能够在椪柑的叶片和成熟果实上存活,但不能引起发病,其寄生具有很强的组织特异性。应用胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides和尖孢炭疽菌C. acutatum的种特异性引物CgInt/ITS4和CaInt/ITS4进行PCR扩增,发现引物CgInt/ITS4能从A类菌株扩增到约450bp目标片段,CaInt/ITS4能从B类菌株中扩增到约490bp目标片段,但该两对引物均不能从C类菌株扩增出片段。选取3种类型部分菌株应用通用引物ITS4／ITS5扩增rDNA-ITS区域,克隆测序结果在NCBI上比对,发现A类型菌株(HN-L01,JX-F10,CQ-L03,GD-B15)与胶孢炭疽菌C.gloeosporioides(AJ301988,AM947679)同源性为99%,B类型菌株(YN01,YN02,YN-3-16)与C. acutatum(AJ301964,AJ301932)的同源性为99%,C类菌株(XY-01,XY-02)与平头炭疽菌C. truncatum(AY266380,AJ301944)相似度为99%。综合国外文献和本研究结果,A和B型可确定为胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides和尖孢炭疽菌C. acutatum: C类型暂定为平头炭疽菌Ctruncatum,鉴于该病菌尚未在柑橘上发生和为害的报道,需要作进一步的研究确定。在获得的菌株中,C. gloeosporioides占96.3%,分布各个采样省份,占据绝对优势；C. acutatum只是从云南瑞丽的莱檬(C.aurantifolia)上发现,占1.4%；而C. truncatum菌株来自云南和广东,只占2.3%。综上所述,引起我国柑橘炭疽病的病原有3个,以胶孢炭疽菌为优势种群。利用5对引物Bt2a／Bt2b,GSF1／GSR1,GDF1／GDR1,CLl／CL2,ITS4／ITS 5分别扩增β-微管蛋白(beta tubulin-2-gene, BT),谷氨酸合成酶(glutamine-synthetase, GS),三磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GDPH),钙调蛋白基因(calmoudulin, Cal)和核糖体DNA转录间隔(ITS)的部分序列,应用软件MEGA4.0的邻接法(neighbor--joining method,N-J)构建系统进化树来研究柑橘上的C. gloeosporioides的群体遗传变异。结果表明：ITS和BT基因序列都不能有效地揭示出C. gloeosporioides种下的变异水平,来自柑橘的菌株以高相似度聚为一类；Cal,GDPH,GS对揭示C. gloeosporioides群体遗传变异是有效的,其中C. gloeosporioides群体依Cal序列可聚为Cal-Ⅰ和Cal-Ⅱ两个亚群,依GDPH可聚为GD-Ⅰ和GD-2Ⅱ两个亚群,依GS序列聚为GS-Ⅰ,GS-Ⅱ,GS-Ⅲ,GS-Ⅳ共4个亚群。3种基因序列形成的各亚群间在菌株构成上有一定的重合性,但又不尽相同。最后将5个基因序列合并后构建的系统进化树显示除了丰富的遗传多样性,包括Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ,Ⅴ,Ⅵ,Ⅶ,Ⅷ共8个小亚群。其中Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ,Ⅴ,Ⅵ构成大亚群Group A, VI,Ⅶ构成另一个大类群Group B。综合分析发现,柑橘上C. gloeosporioides群体遗传变异与地理来源,寄主种类,发病器官等均没有相关性,而与分生孢子的形态大小存在一定的相关性,即,Group A的菌株分生孢子为长棍棒状,长而窄,大小为16.3～18.6×4.7～5.3μm,平均为16.9×5.0μm；Group B菌株的分生孢子为短棍棒形,短而宽,大小12.5～14.7×4.9～6.0μm,平均为13.9×5.4μm.

全文目录


致谢  6-9
摘要  9-11
ABSTRACT  11-14
第一章 文献综述和本研究的意义  14-32
  第一节 柑橘炭疽病  14-26
    1 炭疽病的危害与分布  14-15
    2 炭疽病症状  15-16
    3 炭疽病病原  16-18
    4 病害流行  18-20
      4.1 病害循环  18-20
      4.2 流行因素  20
    5 病害防治  20-26
  第二节 炭疽病菌遗传多样性  26-30
    1 遗传多样性研究方法  26-28
      1.1 同工酶分析技术  26
      1.2 分子标记技术  26-28
      1.3 DNA序列分析  28
    2 植物炭疽病菌遗传研究进展  28-30
      2.1 形态学变异  28-29
      2.2 致病性  29
      2.3 分子手段  29-30
  第三节 本研究的意义  30-32
第二章 柑橘炭疽病病原分离鉴定  32-47
  一 前言  32-33
  二 材料与方法  33-36
    1 供试材料  33
    2 实验方法  33-36
      2.1 菌株分离纯化  33
      2.2 病原菌形态与培养性状  33-34
      2.3 致病性测定  34
      2.4 PCR检测  34-36
  三 结果与分析  36-45
    3.1 分离结果与供试菌株的选择  36-40
    3.2 致病性测定  40-43
    3.3 PCR检测结果  43-44
    3.4 ITS序列分析  44-45
  四 结论与讨论  45-47
第三章 柑橘炭疽病菌群体遗传多样性研究  47-69
  一 前言  47-48
  二 材料与方法  48-51
    2.1 供试材料  48
    2.2 培养性状、孢子形态和多菌灵敏感性  48-49
    2.3 致病性  49
    2.4 基因组DNA提取  49
    2.5 引物设计  49-50
    2.6 PCR反应体系  50
    2.7 克隆测序  50
    2.8 数据分析处理  50-51
  三 结果与分析  51-67
    3.1 菌株来源  51
    3.2 生物学特性  51-52
      3.2.1 菌落特征  51
      3.2.2 生长速率  51
      3.2.3 孢子形态  51-52
    3.3 多菌灵敏感性  52
    3.4 致病性测定  52-56
    3.5 各菌株间遗产多样性分析  56-67
      3.5.1 基于β-微管蛋白基因序列构建的系统进化树  56
      3.5.2 基于ITS序列构建的系统进化树  56
      3.5.3 基于钙调蛋白基因Cal序列构建的系统进化树  56-57
      3.5.4 基于三磷酸脱氢酶GDPH序列构建的系统进化树  57
      3.5.5 基于谷氨酸合成酶GS序列构建的系统进化树  57-58
      3.5.6 基于5基因组合序列构建的系统进化树  58-67
  四 讨论  67-69
参考文献  69-73

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 病虫害及其防治 > 园艺作物病虫害及其防治 > 果树病虫害 > 柑桔类病虫害
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