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梨S-RNase基因启动子克隆及雌雄不育植物表达载体构建

作　者: 刘学英
导　师: 乌云塔娜
学　校: 中南林业科技大学
专　业: 森林培育
关键词: TAIL-PCR S-RNase基因启动子 5’端缺失分析 雌性不育植物表达载体 雌雄不育植物表达载体
分类号: S661.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


我国杨树天然林约300万公顷,人工林约700万公顷,柳树、悬铃木、樟树等园林绿化树种也分布几乎遍及全国,大量植源性污染如飞毛飞絮、果毛、紫黑色浆果等对环境产生了极大的污染,也对人体健康如皮肤过敏、鼻塞、流涕、咳嗽、甚至引发哮喘、过敏性鼻炎等造成严重的影响。减轻植源性飞毛飞絮污染的有效途径之一是利用基因工程手段来培育雄性不育、雌性不育或雌雄均不育的杨柳树、悬铃木、樟树等园林绿化树种新品种,其中雄性不育不能完全有效控制植源性污染,而雌性不育及雌雄均不育园林绿化树种因不产生花粉、种子或果实,即可有效控制植源性污染。梨雌蕊S-RNase基因在雌蕊中特异表达,其启动子为雌蕊特异表达启动子。为了解决上述飞毛飞絮污染问题,本研究对雌蕊特异表达S-RNase基因启动子进行克隆,并此基础上构建了雌性不育植物表达载体和雌雄不育植物表达载体,为培育雌性不育或雌雄均不育园林绿化树种提供了有用的分子工具。主要研究结果如下：1、采用TAIL-PCR扩增梨S12-、S13-、S21-RNase基因5’端上游侧翼序列,长度分别为1448bp,854bp,1137bp,分别命名为PpS12pro (HM047239)、PpS13pro (HM047240)、PbS21pro (HM047241)。PLACE和PlantCARE对其进行顺式调控元件预测发现,三个5’端上游侧翼序列均具有典型TATA box和CAAT box,且上游均存在光应答调控元件(Box 4, G-box)、脱落酸应答元件ABRE及水杨酸应答元件TCA-element等。根据砂梨S12-RNase基因5’端上游侧翼序列调控元件设计一系列5’端缺失片段,并连接到pBI101.2载体的SalⅠ与XbaⅠ酶切位点之间与GUS基因融合,成功构建了6个S12-RNase基因启动子植物表达载体PpS12pro-0-pBI101.2～PpS12pro-5-pBI101.2, Floral Dip法转化哥伦比亚野生型拟南芥,卡那霉素抗性平板筛选并PCR检测分别得到了4、48、17、19、10、19株阳性转基因植株及2、13、8、10、7、12株转基因纯合体植株,用于进一步验证该启动子的表达功能。2、利用花椰菜品种‘绿岭’基因组DNA克隆了花药绒毡层特异BoA9基因启动子和类细胞毒素用途的半胱氨酸蛋白酶基因CysP1。以PpS12pro-pBI101.2为基础,在砂梨S12-RNase基因启动子下游XbaⅠ与XmaⅠ酶切位点之间插入半胱氨酸蛋白酶基因CysP1,构建了雌性不育植物表达载体PpS12pro-CysP1-pBI101.2;在此基础上,在PpS12pro-CysP1-pBI101.2上的Apa I与Cla I酶切位点之间反向插入BoA9pro-CysP 1融合基因,成功构建了雌雄不育植物表达载体BoA9pro-CysPl-PpS12pro-CysP1-pBI101.2.雌性不育植物表达载体和雌雄不育植物表达载体分别可用于雌雄异株和雌雄同株的园林绿化树种的雌株的转基因改良,从而获得无果无籽的园林绿化树种的新品种,试图有效制止飞毛飞絮漫天飘飞现象。

全文目录


摘要  4-6
ABSTRACT  6-8
缩略词  8-13
第一部分 文献综述  13-33
  1 植物自交不亲和性及其普遍性  13-14
  2 国内外梨自交不亲和性的研究进展  14-16
  3 植物基因启动子的结构特征及分类  16-21
    3.1 启动子的一般结构特征  16-19
      3.1.1 核心启动子组件  17-18
      3.1.2 上游启动子元件  18-19
    3.2 植物启动子的分类和应用  19-21
      3.2.1 组成型启动子  19-20
      3.2.2 组织特异型启动子  20-21
      3.2.3 诱导型启动子  21
  4 植物基因启动子分离克隆方法  21-26
    4.1 通过构建及筛选基因组文库来克隆启动子  21-22
    4.2 利用PCR技术克隆启动子  22-26
      4.2.1 利用常规PCR技术克隆启动子  22
      4.2.2 利用改进的PCR技术克隆启动子  22-26
  5 植物遗传转化研究进展  26-28
    5.1 载体介导转化法  26-27
    5.2 直接遗传转化方法  27-28
      5.2.1 基因枪法  27
      5.2.2 电激法  27-28
      5.2.3 PEG法  28
    5.3 种质系统转化法  28
  6 S-RNase基因启动子国内外研究现状  28-30
  7 本研究的目的、意义及研究方案  30-33
    7.1 本研究的目的意义  30-32
    7.2 技术路线  32-33
第二部分 论文正文  33-77
  1 梨S-RNase基因启动子的扩增及功能分析  33-67
    1.1 材料与方法  33-46
      1.1.1 实验材料  33-34
        1.1.1.1 植物材料  33
        1.1.1.2 菌株与试剂  33-34
      1.1.2 实验方法  34-46
        1.1.2.1 梨基因组总DNA提取  34
        1.1.2.2 梨S-RNase基因5'端上游侧翼序列的TAIL-PCR扩增及验证  34-37
        1.1.2.3 TAIL-PCR产物的回收及与pMD18-T克隆载体的连接  37
        1.1.2.4 大肠杆菌感受态细胞的制备  37-38
        1.1.2.5 连接产物的转化  38
        1.1.2.6 重组子的PCR鉴定  38-39
        1.1.2.7 5'端上游侧翼序列网上BLAST及功能元件分析  39
        1.1.2.8 蔷薇科启动子序列系统发育树的构建  39
        1.1.2.9 砂梨S_(12)-RNase基因启动子5'端缺失引物设计  39-40
        1.1.2.10 植物表达载体pBI101.2  40-41
        1.1.2.11 PCR扩增启动子缺失DNA模板  41-42
        1.1.2.12 砂梨S_(12)-RNase基因启动子缺失片段PCR扩增  42
        1.1.2.13 重组质粒的提取  42
        1.1.2.14 缺失表达载体构建  42-43
        1.1.2.15 农杆菌感受态细胞的制备  43-44
        1.1.2.16 电击转化法  44
        1.1.2.17 农杆菌Floral Dip法转化拟南芥  44-45
        1.1.2.18 拟南芥转基因纯合系的筛选  45-46
    1.2 结果与分析  46-65
      1.2.1 梨基因组DNA的提取  46-47
      1.2.2 梨S-RNase基因5'端上游侧翼序列TAIL-PCR扩增  47-49
      1.2.3 梨S-RNase基因5'端上游侧翼序列的比对分析  49-54
      1.2.4 S_(13)-、S_(12)-、S_(21)-RNase基因启动子功能元件预测  54-58
      1.2.5 蔷薇科S-RNase基因启动子系统进化分析  58-59
      1.2.6 砂梨S_(12)-RNase基因启动子5'端缺失片段的PCR扩增  59-60
      1.2.7 砂梨S_(12)-RNase基因启动子5'端缺失植物表达载体构建  60-62
      1.2.8 阳性农杆菌菌株的PCR鉴定  62-63
      1.2.9 转基因植株T1代筛选  63
      1.2.10 PCR鉴定转基因拟南芥植株  63-64
      1.2.11 拟南芥转基因纯合系的筛选结果  64-65
    1.3 小结与讨论  65-67
  2 植物雌性不育及雌雄不育植物表达载体的构建  67-77
    2.1 材料与方法  68-72
      2.1.1 植物材料  68
        2.1.1.1 植物材料  68
        2.1.1.2 菌株与试剂  68
      2.1.2 实验方法  68-72
        2.1.2.1 西兰花基因组总DNA提取  68
        2.1.2.2 引物设计  68-69
        2.1.2.3 花药绒毡层特异表达基因BoA9启动子的扩增  69
        2.1.2.4 诱导不育的半胱氨酸蛋白酶基因CysP1的扩增  69
        2.1.2.5 雌性不育植物表达载体的构建  69-70
        2.1.2.6 雄性不育中间载体的构建  70-71
        2.1.2.7 雌雄不育植物表达载体的构建  71-72
    2.2 结果与分析  72-76
      2.2.1 花药绒毡层特异表达基因BoA9启动子PCR扩增  72-73
      2.2.2 诱导不育的半胱氨酸蛋白酶基因CysP1的PCR扩增  73-74
      2.2.3 雌性不育植物表达载体PpS_(12)pro-CysP1-pBI101.2的构建  74
      2.2.4 雄性不育中间载体的构建  74-75
      2.2.5 雌雄不育植物表达载体的构建  75-76
    2.3 小结与讨论  76-77
结论  77-78
创新点  78-79
参考文献  79-88
附录  88-90
致谢  90-91
攻读学位期间的主要学术成果  91

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中图分类: > 农业科学 > 园艺 > 果树园艺 > 仁果类 > 梨
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