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基于matK基因和ITS序列的海南野生兰科植物DNA条形码探讨

作　者: 黄明忠
导　师: 莫饶
学　校: 海南大学
专　业: 种质资源学
关键词: 海南野生兰科植物 DNA条形码 matK ITS
分类号: S682.31
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 448次
引　用: 2次
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内容摘要

兰科植物(Orchidaceae)为不易鉴别的植物类群,特别是在非生育期,许多种类间的植株形态差别细微,难于用传统分类法区别开来。不少兰科植物容易自然杂交,中间类型多,变异较大,其分类界限不是很明确,给属间、属内种的分类和整理带来了很大的困难。DNA条形码技术利用DNA片段快速鉴别物种,是分类学中辅助物种鉴定的新技术,是目前分子生物学和分类学发展的最新方向。本研究以158份海南野生兰植物为研究材料,运用叶绿体matK基因和核糖体ITS序列两个片段作为海南野生兰科植物DNA条形码进行区分和鉴定,主要结果如下：(1) matK基因和ITS序列达到理想的DNA条形码候补片段的要求,可用作海南野生兰科植物DNA条形码的研究。研究表明,matK基因有效长度在800bp左右,ITS序列为600bp左右,其长度符合作为DNA条形码的要求。matK基因和ITS序列均有较多的信息位点数,分别为320bp和434bp,包含足够的生物信息。在供试的有效材料中,单独使用matK基因和ITS序列的鉴别效力分别达到96.90%和81.08%。(2)构建了基于matK基因和ITS序列的海南野生兰科植物DNA条形码的技术体系。利用引物matK4(390f/1326r)和ITS2 (AB101f/AB102r),通过对PCR反应的优化研究,结果表明通过向反应体系添加增强子可解决ITS扩增难的问题,在供试的158份材料中ITS和matK均得到100%的扩增；通过探讨,选用K2P遗传距离分析、Wilconxon秩和检验及NJ系统发育树分析,集成DNA条形码分析方法。(3)建立一种广谱、简便和微量的兰科植物基因组DNA的提取方法——改良的CTAB法(方法4)。对所有供试的150余种(涉及4个亚科,70个属)兰科植物进行DNA提取,结果表明该法可高效除去野生兰叶片中的酚类、多糖和蛋白质等杂质,DNA大小约23kb,A260/A280在1.6-2.0之间,产量在158-508 ng/μl之间,能满足后续研究的要求。(4)基于叶绿体matK基因和核糖体ITS序列构建的系统发育树,有效地对海南野生兰科植物进行辅助鉴定,具有较高的鉴定率。依据系统发育树结合现有的形态学资料,成功地将17个未识别种中的7个鉴定到种,10个鉴定到属。(5)获得海南野生兰的145个matK基因序列和151个ITS序列,可用于海南野生兰科植物DNA条形码数据库的构建。其中,有102个种的matK基因序列和89个种的ITS序列在Genebank上未见登录。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-7
目录  7-9
1 前言  9-20
  1.1 植物DNA条形码的研究进展  9-15
    1.1.1 DNA条形码技术的概念  10-11
    1.1.2 植物DNA条形码候补片段的研究  11-14
    1.1.3 DNA条形码技术流程和分析方法  14-15
  1.2 兰科植物DNA条形码的研究进展  15-16
  1.3 海南野生兰科植物的研究概况  16-19
    1.3.1 海南野生兰科植物的种类  16-17
    1.3.2 海南野生兰科植物种植资源的保存、评价及创新利用研究  17-18
    1.3.3 海南野生兰科植物的保护现状  18-19
  1.4 研究的目的意义  19
    1.4.1 目的  19
    1.4.2 意义  19
  1.5 技术路线  19-20
2 材料与方法  20-32
  2.1 实验材料  20-23
  2.2 主要仪器和试剂  23-24
    2.2.1 主要仪器  23-24
    2.2.2 主要药品和试剂  24
  2.3 实验方法  24-32
    2.3.1 基因组总DNA的提取  24-26
    2.3.2 样品DNA的PCR扩增  26-27
    2.3.3 PCR产物测序  27-28
    2.3.4 数据处理  28-32
3 结果与分析  32-46
  3.1 DNA提取  32-35
  3.2 PCR扩增  35-37
    3.2.1 引物的筛选  35
    3.2.2 PCR反应的优化  35-37
  3.3 测序结果及DNA序列的校对  37
  3.4 数据分析  37-46
    3.4.1 序列分析  37
    3.4.2 Wilconxon秩和检验  37-38
    3.4.3 遗传距离分析及"DNA Barcoding Gap"评估  38-40
    3.4.4 系统学分析  40-46
4 讨论  46-49
  4.1 DNA的提取  46-47
  4.2 关于ITS序列PCR扩增难问题  47
  4.3 关于测序的成功率  47
  4.4 关于片段的进化速度  47-48
  4.5 关于种内重复数及物种的识别效率  48
  4.6 基于系统发育树的辅助鉴定  48-49
5 结论  49-50
参考文献  50-61
致谢  61

基于matK基因和ITS序列的海南野生兰科植物DNA条形码探讨

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