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红树林来源Streptomyces sp.OUC6819中多烯大环内酯类抗生素的生物合成研究

作　者: 张慧
导　师: 李文利
学　校: 中国海洋大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: Streptomyces sp.OUC6819 多烯大环内酯类化合物 基因组文库 PCR targeting 同源重组 opeF 正调控子
分类号: TQ465.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


Streptomyces sp.OUC6819分离于我国广东省红树林保护区芦苇根际土壤,能够产生一类具有抗真菌活性的32元多烯大环内酯类化合物(Polyene Macrolides, PEMs)。本论文以Streptomyces sp.OUC6819为研究对象,主要围绕PEMs的生物合成开展了以下研究工作：首先,对Streptomyces sp.OUC6819最适的生长条件进行了摸索。在不同培养基(MS, ISP2, ISP4, COM,高氏),盐浓度(0%-10%)条件下培养,实验结果确定最佳产孢培养条件为ISP2培养基,28℃,盐浓3.3%,pH=7.2。通过抗性敏感实验确定了Streptomyces sp.OUC6819对Thiostrepton n Kanamycin和Erythromycin的敏感性。其次,成功构建了Streptomyces sp.OUC6819的基因组文库。从Streptomyces sp.OUC6819中提取基因组DNA,经过Sau3AI部分酶切,脱磷,回收35-45kb左右的DNA片段,与经XbaI酶切并脱磷,再用BamHI处理的载体SuperCos1相连接,连接产物经包装蛋白包装,然后侵染宿主细胞(?)Escherichia coli Trans10,构建成Streptomyces sp.OUC6819的基因组文库。对该文库进行了质量鉴定,结果表明：文库的效价达6.0×106cfu/mL,经EcoRI、BamHI和XhoY酶切验证基因文库随机性良好。所建文库的各项指标均达到要求,克隆子分装保存于—80℃冰箱。基因组文库的构建为次级代谢产物生物合成基因簇的克隆,基因功能研究以及异源表达奠定了基础。接着,对Streptomyces sp.OUC6819中多烯大环内酯类生物合成基因簇进行了克隆与生物信息学分析。研究结果表明,多烯大环内酯类化合物生物合成整个基因簇共98kb,由14个开放阅读框(Open Reading Frames, ORFs)组成,其中有4个Ⅰ型聚酮合酶(Polyketide synthase, PKS)基因(opeG、opeH、opel和opeJ),5个可能的调控基因(ppeA、opeC、opeD、opeE和opeF),1个抗性基因(opeK),1个Ⅱ型硫酯酶基因(opeM),1个CoA连接酶基因(ppeN)和两个未知功能基因(opeB和opeL)。本论文采用PCR targeting方法构建了用于调控基因opeA、opeC和opeF双交换同源重组的质粒ZH1、ZH2、ZH3,通过接合转移方法将重组质粒ZH3导入野生株Streptomyces sp.OUC6819之中,获得了opeF基因阻断突变株。对野生株和opeF基因突变株进行发酵,经HPLC-MS分析表明：突变株丧失了多烯大环内酯(分子式C36H58O10)的合成能力,证实了opeF基因是多烯大环内酯生物合成中的正调控子。最后,在转录水平上研究了opeF基因对基因簇中其它基因的调控,RT-PCR结果表明,opeF基因是以正调控方式调控基因簇中的opeA、opeE、opeF、opeG、 opeK、opeM和opeN基因,这为进一步进行基因工程改造提供理论支持。

全文目录


摘要  5-7
Abstract  7-12
1 前言  12-22
  1.1 研究背景  12-13
  1.2 海洋放线菌研究的历史  13-14
  1.3 海洋放线菌的分布和分类  14-15
  1.4 海洋放线菌来源的次级代谢产物  15
  1.5 多烯大环内酯类化合物  15-20
    1.5.1 多烯大环内酯类化合物的生物活性与研究进展  15-16
    1.5.2 多烯大环内酯类化合物的生物合成  16-20
    1.5.3 多烯大环内酯类化合物的组合生物合成  20
  1.6 本研究的目的和意义  20-22
2 Streptomyces sp.OUC6819最适生长条件的摸索  22-29
  2.1 引言  22
  2.2 实验材料  22-25
    2.2.1 菌株  22
    2.2.2 实验仪器  22-23
    2.2.3 培养基  23-25
    2.2.4 抗生素及其使用浓度  25
  2.3 实验方法  25-26
    2.3.1 Streptomyces sp.OUC6819最适培养条件的摸索  25
    2.3.2 抗生素敏感实验  25-26
    2.3.3 Streptomyces sp.OUC6819的菌种保藏  26
  2.4 实验结果与分析  26-28
    2.4.1 Streptomyces sp.OUC6819最适培养条件的摸索  26-28
    2.4.2 抗生素敏感实验  28
  2.5 小结  28-29
3 Streptomyces sp.OUC6819基因组文库的构建  29-40
  3.1 引言  29
  3.2 实验材料  29-31
    3.2.1 菌株与质粒  29-30
    3.2.2 实验试剂  30
    3.2.3 实验仪器  30
    3.2.4 生化试剂  30-31
  3.3 实验方法  31-36
    3.3.1 Streptomyces sp.OUC6819基因组DNA的提取及纯化  31-32
    3.3.2 基因组DNA的部分酶切  32-33
    3.3.3 低熔点琼脂糖凝胶筛选目的片段DNA及目的片段的去磷酸化  33-34
    3.3.4 载体SuperCos1的处理  34
    3.3.5 载体和目的片段的连接反应  34-35
    3.3.6 体外包装  35
    3.3.7 侵染适宜的宿主菌  35-36
    3.3.8 文库质量的检测  36
    3.3.9 基因文库的保存  36
  3.4 实验结果与分析  36-39
    3.4.1 基因组DNA的提取  36-37
    3.4.2 基因组片段的部分酶切  37
    3.4.3 载体的处理及与目的片段的连接  37-38
    3.4.4 文库效价的检测  38-39
    3.4.5 文库质量的检测  39
  3.5 小结  39-40
4 多烯大环内酯类生物合成基因簇的克隆与鉴定  40-60
  4.1 引言  40-41
  4.2 实验材料  41-44
    4.2.1 菌株和质粒  41-43
    4.2.2 本章节所用的引物  43
    4.2.3 培养基和抗生素使用浓度  43
    4.2.4 生化试剂  43-44
    A b st r ac t  44
  4.3 实验方法  44-51
    4.3.1 Streptomyces sp.OUC6819基因组文库的筛选  44
    4.3.2 含有gap的DNA片段的亚克隆  44
    4.3.3 PCR及相关技术  44-45
    4.3.4 DNA的纯化(试剂盒法)  45-46
    4.3.5 琼脂糖凝胶电泳中DNA片段的胶回收  46
    4.3.6 大肠杆菌的感受态细胞制备(CaCl2法)及转化  46-47
    4.3.7 DNA连接反应  47
    4.3.8 大肠杆菌中质粒的快速检测  47-48
    4.3.9 大肠杆菌质粒的小量提取  48-49
    4.3.10 Streptomyces sp.OUC6819胞内R-M反应液的制备  49
    4.3.11 大肠杆菌—链霉菌间接合转移  49-50
    4.3.12 HPLC及ESI-MS分析  50-51
    4.3.13 序列分析网站  51
    4.3.14 其他  51
  4.4 实验结果与分析  51-58
    4.4.1 Streptomyces sp.OUC6819基因组文库的筛选  51-52
    4.4.2 Streptomyces sp.OUC6819基因簇的生物信息学分析  52-55
    4.4.3 Streptomyces sp.OUC6819限制修饰系统(restriction-modification system，R-M系统)的研究  55-56
    4.4.4 调控基因opeA、opeC、opeF阻断质粒的构建  56
    4.4.5 Streptomyces sp.OUC6819中opeF基因双交换同源重组  56-57
    4.4.6 opeF基因阻断突变株多烯大环内酯类化合物产生情况的检测  57-58
  4.5 小结  58-60
5 opeF基因调控机制的研究  60-67
  5.1 引言  60
  5.2 实验材料  60-61
    5.2.1 菌株和质粒  60
    5.2.2 培养基  60
    5.2.3 生化试剂  60-61
    5.2.4 本章节用到的引物  61
    5.2.5 实验仪器  61
  5.3 实验方法  61-64
    5.3.1 RNA的提取  61-62
    5.3.2 DNaseI处理RNA样品  62
    5.3.3 RNA浓度和纯度的检测  62-63
    5.3.4 cDNA的合成  63
    5.3.5 RT-PCR  63-64
  5.4 实验结果与分析  64-66
    5.4.1 RNA提取的质量检测  64-65
    5.4.2 RT-PCR测定opeF基因的表达  65-66
  5.5 小结  66-67
6 结语与创新点  67-69
  6.1 结语  67-68
  6.2 创新点  68
  6.3 未来工作展望  68-69
参考文献  69-76
致谢  76-77
个人简历及在校期间发表的论文  77-78

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中图分类: > 工业技术 > 化学工业 > 制药化学工业 > 抗菌素制造 > 大环内脂族抗菌素
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