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深海嗜冷杆菌低温脂肪酶基因的克隆表达、酶的纯化及性质研究

作　者: 陈瑞鹏
导　师: 郭立忠；党宏月
学　校: 青岛农业大学
专　业: 微生物学
关键词: 嗜冷杆菌 低温脂肪酶 基因组文库 基因表达 重组脂肪酶 深海沉积物
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


脂肪酶(lipases, E.C.3.1.1.3),全称为三酰甘油酰基水解酶(triacylglycerol acylhydrolase),属于α/β折叠酶家族,是一类丝氨酸水解酶。它们在非水介质中有较高的活力和稳定性,所以可以用来催化有机反应,如酯化和转酯化反应。由于低温脂肪酶在低温条件下(0℃～30℃)具有良好的催化特性,Kcat值和生理效率(Kcat/Km)高,活化能低,具有反应条件温和、副产物少,可以节约能源保护环境,因此广泛用于工业生产,也因此成为国内外酶学研究的热点。本研究从实验室保存的80株筛选于冲绳海槽的菌株中,用三丁酸甘油酯和Tween 80筛选出1株产低温脂肪酶的菌株,经16S rRNA基因序列分析鉴定为嗜冷杆菌,并定名为Psychrobacter sp. C18。考虑到此菌株的低温难培养和产酶量低的缺点,我们对低温脂肪酶基因进行了中温宿主的克隆与表达研究。采用限制性内切酶Sau3A I酶切基因组DNA,回收2～7kb的DNA片段,然后与事先经BamH I酶切且去磷酸化的质粒载体pUC19连接,转化大肠杆菌DH5a,以此建立基因组DNA文库,采用三丁酸甘油酯平板和蓝白斑筛选相结合的方法从基因文库中筛选到2株阳性克隆命名为pL1和pL2,测序分析表明为同一克隆。该核苷酸序列包含有完整的阅读框,共945bp,编码315个氨基酸,预测其分子量为35,028Da,将此序列提交GenBank,得到登陆号为：GU583649,并定义此脂肪酶基因为lipX。该酶包含大多数脂肪酶都存在的以Ser为中心的保守序列GNSMG (GxSxG, x为任意碱基),和保守域HG。以lipX的开放阅读框设计引物,使其C-末端带有His-tag,并去掉N端信号肽序列,PCR产物酶切后转化已酶切后的pET-28a(+)构建表达载体pET28a(+)/lipXHis,转化大肠杆菌BL21 (DE3)。优化表达条件,其最佳表达条件是：37℃培养至OD600nm值为0.6时加入终浓度为0.1 mM的IPTG,20℃诱导表达8 h。用镍柱亲和层析纯化脂肪酶,最后纯化倍数为10.7,产量达59.1%,最终得到酶活为623.3U/mg的纯酶。研究其酶学性质发现,该脂肪酶的最适作用温度为30℃,并且在小于30℃的温度范围内稳定,40℃还保持80%的活力；其最适作用pH为8.0,因此属于碱性低温脂肪酶；Ca2+, Mg2+, K+, Cu2+对酶有激活作用而Zn2+, Co2+, Mn2+, Fe3+都对酶活有抑制作用,其中Zn2+对脂肪酶活性的抑制作用最大；一定浓度的盐度对脂肪酶有显著激活作用,非极性的表面活性剂对酶有激活作用,但是极性表面活性剂SDS强烈抑制脂肪酶活力,低浓度的有机溶剂有一定的耐受性,说明此酶可用于有机合成；底物选择实验结果表明LipXHis偏于中长C链脂肪酸酯底物。

全文目录


摘要  13-15
Abstract  15-17
1 绪论  17-33
  1.1 脂肪酶概述  17-20
    1.1.1 脂肪酶定义  17
    1.1.2 微生物脂肪酶  17-18
    1.1.3 低温微生物脂肪酶  18-20
  1.2 微生物脂肪酶研究进展  20-23
    1.2.1 产脂肪酶微生物的筛选  20
    1.2.2 微生物脂肪酶的理化性质  20-21
    1.2.3 低温微生物脂肪酶的结构特征  21-22
    1.2.4 低温微生物脂肪酶的固定化  22-23
  1.3 分子生物学在低温脂肪酶中的应用  23-25
    1.3.1 低温脂肪酶基因的克隆  23-24
    1.3.2 低温脂肪酶基因的表达  24-25
  1.4 微生物脂肪酶的应用现状与前景  25-30
    1.4.1 食品加工方面的应用  26
    1.4.2 洗涤剂方面的应用  26-27
    1.4.3 环境修复方面的研究  27
    1.4.4 生产可降解材料  27
    1.4.5 纺织工业的应用  27-28
    1.4.6 手性化合物合成中的应用  28
    1.4.7 化妆品的应用  28
    1.4.8 皮革生产  28
    1.4.9 生物柴油制备方面的应用  28-29
    1.4.10 纸浆和造纸  29-30
  1.5 冲绳海槽海洋环境  30
  1.6 本研究的目的和意义  30-31
  1.7 研究内容  31-32
  1.8 技术路线  32-33
2 产低温脂肪酶菌株的筛选与分子鉴定  33-42
  2.1 实验材料  33-34
    2.1.1 样品的采集  33
    2.1.2 培养基及试剂  33-34
  2.2 实验方法  34-36
    2.2.1 筛选方法  34
    2.2.2 摇瓶培养  34
    2.2.3 脂肪酶活力的测定  34-35
    2.2.4 对硝基苯酚(p-NP)标准曲线的测定及微摩尔消光系数的测定  35
    2.2.5 产脂肪酶菌株的16S rDNA分子鉴定  35-36
    2.2.6 脂肪酶活性中心的PCR扩增  36
    2.2.7 产脂肪酶菌株生长曲线及酶活曲线测定  36
  2.3 实验结果  36-40
    2.3.1 产低温脂肪酶菌株的筛选  36-37
    2.3.2 低温产脂肪酶菌株的16S rDNA分子鉴定及系统发育树的构建  37-38
    2.3.4 脂肪酶活性中心的PCR扩增  38-39
    2.3.5 对硝基酚标准曲线的测定  39
    2.3.6 Psychrobacter sp. C18生长曲线与酶活曲线的测定  39-40
  2.4 讨论  40-42
3 低温脂肪酶基因克隆  42-54
  3.1 实验材料  43
    3.1.1 菌株和质粒  43
    3.1.2 工具酶和化学试剂  43
    3.1.3 培养基  43
  3.2 染色体DNA文库的构建  43-47
    3.2.1 菌株Psychrobacter sp. C18基因组DNA的提取  43-44
    3.2.2 pUC19质粒DNA的提取  44
    3.2.3 质粒的去磷酸化  44-46
    3.2.4 基因组DNA的酶切  46
    3.2.5 CaCl_2法感受态细胞的制备  46
    3.2.6 连接反应  46-47
    3.2.7 连接产物的转化  47
  3.3 阳性克隆的鉴定  47-48
    3.3.1 提取质粒验证插入片段大小  47
    3.3.2 阳性克隆子的序列测定  47-48
  3.4 结果与讨论  48-52
    3.4.1 基因组DNA的提取  48
    3.4.2 基因组DNA的酶切  48-49
    3.4.3 质粒载体的制备  49-50
    3.4.4 基因文库的构建  50
    3.4.5 序列测定和分析  50-52
    3.4.6 低温脂肪酶基因lipX系统发育树分析  52
  3.5 讨论  52-54
4 低温脂肪酶LipX在大肠杆菌中的表达及表达条件的优化  54-69
  4.1 材料  54-55
    4.1.1 限制性内切酶、质粒载体和菌株  54
    4.1.2 引物与试剂  54-55
    4.1.3 培养基  55
  4.2 实验方法  55-62
    4.2.1 表达载体pET-28a(+)/lipX_(His)的构建  55-59
    4.2.2 阳性克隆的鉴定  59
    4.2.3 目的基因的诱导表达  59
    4.2.4 表达条件优化  59-60
    4.2.5 脂肪酶活力的测定  60
    4.2.6 蛋白含量的测定  60-61
    4.2.7 蛋白分子量的测定  61-62
  4.3 结果与讨论  62-67
    4.3.1 表达载体的构建  62-64
    4.3.2 表达条件优化  64-67
    4.3.3 蛋白浓度标准曲线的测定  67
  4.4 小结  67-69
5 嗜低温脂肪酶LipX的分离纯化与酶学性质研究  69-81
  5.1 实验材料  69-70
    5.1.1 实验菌株  69
    5.1.2 主要试剂  69-70
    5.1.3 主要试剂的配制  70
  5.2 实验方法  70-73
    5.2.1 脂肪酶的纯化  70-71
    5.2.2 脂肪酶LipX_(His)的酶学性质  71-73
  5.3 结果与讨论  73-79
    5.3.1 脂肪酶的纯化  73-74
    5.3.2 脂肪酶LipX_(His)的酶学性质  74-79
  5.4 讨论  79-81
6 低温脂肪酶LipX的生物信息学分析  81-91
  6.1 实验材料  81-82
    6.1.1 实验菌株  81
    6.1.2 生物软件及工具  81-82
  6.2 结果与讨论  82-90
    6.2.1 低温脂肪酶同源序列分析  82-83
    6.2.2 信号肽序列的预测  83-84
    6.2.3 疏水性分析  84-85
    6.2.4 蛋白质一级结构分析  85-86
    6.2.5 结构域预测与分析  86
    6.2.6 脂肪酶二级结构预测  86-88
    6.2.7 蛋白的同源建模  88-90
  6.3 小结  90-91
7 结论与展望  91-93
参考文献  93-98
主要实验仪器  98-99
致谢  99-100
攻读硕士期间发表论文情况  100-102
导师组意见  102

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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