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双重组菌偶联不对称还原制备（S）-4-氯-3-羟基丁酸乙酯

作　者: 吴小芳
导　师: 朱笃
学　校: 江西师范大学
专　业: 生物催化
关键词: 不对称还原酮还原酶葡萄糖脱氢酶 4-氯乙酰乙酸乙酯 (S)-4-氯-3羟基丁酸乙酯
分类号: TQ460.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

具有光学活性的羟基化合物是手性药物合成的重要中间体。利用微生物细胞或酶进行生物催化制备手性化合物具有反应条件温和、转化率高和立体选择性高等优点，是一条有效的合成手性化合物途径。(S)-4-氯-3羟基丁酸乙酯(Ethyl S-4-chloro-3-hydorxybuytrate，S-CHBE)是合成甲基戊二酰辅酶A (HMG-CoA)还原酶抑制剂的关键手性砌块。其经济有效的制备途径是以4-氯乙酰乙酸乙酯(Ethyl4-chloroacetoacetate，COBE)为原料，由生物催化不对称还原获得。本研究利用jcat软件，对来源于Candida magnoliae (Genbank Ace. No. JC7338;GI:11360538)的氨基酸序列进行了E. coli密码子偏嗜性优化，人工设计并合成了酮还原酶（Ketoreductase， KRED）基因序列，成功地构建了重组大肠杆菌BL21/pET28a-kred。对该重组菌进行发酵和诱导条件优化，该重组菌表达酮还原酶比酶活达到了11.49U/mg。利用重组菌E. coli BL21/pET28a-kred可以不对称还原COBE生成S-CHBE。由于利用重组菌E. coli BL21/pET28a-kred不对称还原COBE制备S-CHBE的反应需要辅酶NAD(P)H参与提供氢原子。为了避免过多的使用昂贵的辅酶，本研究从枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中克隆出葡萄糖脱氢酶(glucose dehydrogenase，GDH)基因，构建重组菌E. coli BL21/pET28a-gdh，实现了葡萄糖脱氢酶高效表达。该重组菌利用葡萄糖作为底物可为反应提供还原力。对重组菌E. coli BL21/pET28a-kred与E. coli BL21/pET28a-gdh偶联不对称催化COBE的工艺进行优化，研究结果表明：在单水相中（磷酸盐缓冲体系pH7.0）、25C、葡萄糖50g/L以及底物COBE24.2g/L的条件下反应12h，双重组菌按照菌体湿重1:1比例（分别为20g/L）混合，产物S-CHBE的得率达到92.6%，对映体过量值（e.e）达100%。反应中无需要额外添加辅酶NADP+。该研究结果充分显示了酮还原酶KRED在手性醇合成中具有良好的应用前景，为利用微生物工业化制备(S)-CHBE奠定了坚实基础。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-8
第一章文献综述  8-18
  1.1 手性化合物概述  8-9
  1.2 手性化合物制备的主要方法  9-11
    1.2.1 对映体拆分  9-10
    1.2.2 化学法合成  10
    1.2.3 生物法合成  10-11
  1.3 光学活性的β-羟基酯的应用  11-12
  1.4 COBE 和 CHBE  12-13
    1.4.1 4-氯乙酰乙酸乙酯（ Ethyl 4-Chloroacetoacetate, COBE )  12
    1.4.2 4-氯-3 羟基丁酸乙酯( Ethyl 4-Chloro-3-hydrozybutanoate，CHBE )  12-13
  1.5 生物法制备 S-CHBE  13-17
    1.5.1 生物法还原 COBE 生产 S-CHBE 的机理  13-14
    1.5.2 辅酶再生  14-15
    1.5.3 生物制备 S-CHBE 的研究现状  15-17
  1.6 本论文的研究目的及意义  17
  1.7 本论文研究的主要内容  17-18
第二章酮还原酶表达载体的构建及高效表达  18-33
  2.1 引言  18
  2.2 材料和方法  18-24
    2.2.1 菌株及质粒  18-20
    2.2.2 培养基  20
    2.2.3 主要实验试剂  20
    2.2.4 主要仪器设备  20
    2.2.5 酮还原酶基因的人工合成  20-21
    2.2.6 感受态细胞的制备及转化  21
    2.2.7 表达载体 pET28a-kred 的构建  21
    2.2.8 表达载体 pTrc-kred 的构建  21
    2.2.9 重组菌培养条件  21-23
    2.2.10 细胞生长测定  23
    2.2.11 酶活的测定  23-24
    2.2.12 SDS-PAGE 检测目的蛋白  24
    2.2.13 重组菌细胞催化 COBE 不对称还原反应  24
    2.2.14 底物和产物分析  24
  2.3 重组表达酮还原酶  24-27
    2.3.1 重组质粒的酶切验证  24-25
    2.3.2 构建的重组表达菌株  25
    2.3.3 酮还原酶表达体系的筛选  25-26
    2.3.4 重组菌 BL21(DE3)/pET28a-kred 的 SDS-PAGE 分析  26-27
  2.4 重组菌 BL21(DE3)/pET28a-kred 培养条件的优化  27-31
    2.4.1 培养基的选择  27-28
    2.4.2 诱导时期的优化  28-29
    2.4.3 IPTG 浓度的优化  29
    2.4.4 诱导温度的优化  29-30
    2.4.5 诱导时间的优化  30-31
  2.5 重组菌 BL21(DE3)/pET28a-kred 转化 COBE 的研究  31-32
  2.6 小结  32-33
第三章葡萄糖脱氢酶(GDH)基因的表达  33-38
  3.1 引言  33
  3.2 材料与方法  33-36
    3.2.1 质粒与菌株  33
    3.2.2 培养基与培养条件  33
    3.2.3 质粒抽提  33
    3.2.4 葡萄糖脱氢酶 NDA 获得  33-34
    3.2.5 葡萄糖脱氢酶表达载体的构建  34-35
    3.2.6 葡萄糖脱氢酶酶活力的测定  35-36
  3.3 葡萄糖脱氢酶基因的表达  36
  3.4 重组菌 E. coli BL21(DE3)/pET28a-gdh 再生辅酶  36-37
  3.5 小结  37-38
第四章双重组菌偶联不对称还原 COBE 生产 S-CHBE  38-47
  4.1 引言  38
  4.2 材料和方法  38-39
    4.2.1 菌种  38
    4.2.2 培养基和培养方法  38
    4.2.3 分析方法  38-39
  4.3 双重组菌不对称催化还原 COBE  39-46
    4.3.1 催化形式对不对称还原 COBE 的影响  39
    4.3.2 双菌细胞量比例对不对称还原 COBE 的影响  39-40
    4.3.3 细胞量对不对称还原 COBE 的影响  40-41
    4.3.4 辅因子及辅酶再生对不对称还原 COBE 的影响  41
    4.3.5 辅助底物对不对称还原 COBE 的影响  41-42
    4.3.6 底物浓度不对称还原 COBE 的影响  42-43
    4.3.7 转化温度对不对称还原 COBE 的影响  43-44
    4.3.8 pH 对不对称还原 COBE 的影响  44-45
    4.3.9 转速对不对称还原 COBE 的影响  45-46
  4.4 小结  46-47
结论  47-48
参考文献  48-53
致谢  53-54
在读期间公开发表论文（著）及科研情况  54

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