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基于烯基桥联反应多分离特性杂化整体柱研究

作　者: 陈应庄
导　师: 姚守拙
学　校: 湖南大学
专　业: 分析化学
关键词: 毛细管电泳电渗流毛细管电色谱纳升液相色谱整体柱聚合物整体柱 TMOS整体柱 VTMS整体柱 γ-MAPS-TMOS 杂化整体柱蛋白蛋白质组学酶酶微反应器在线酶解双相杂化整体柱在线预富集两性杂化整体柱亲水色谱
分类号: O658
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

作为微分离领域核心之一的整体柱技术，它以其高效的传质性能和卓越的分离性能，日益受到研究者们的重视，已成功应用于蛋白质组学，药用植物学，代谢组学等领域。整体柱主要包括有机基质整体柱和硅胶基质整体柱两种，有机基质整体柱虽然种类繁多但是柱床稳定性较差，硅胶基质整体柱虽然有稳定柱床，但是由于表面衍生繁琐等问题，导致硅胶基质整体柱种类较少。尽管整体柱的应用越来越广，但因为柱材料稳定性和官能团多样性不能统一的，大大限制了整体柱的可持续发展。近年出现的结合有机整体柱和硅胶整体柱优点的简单硅胶基质杂化整体柱（如乙烯基硅胶杂化整体柱（VTMS整体柱），巯丙基整体柱等）和聚合物有机硅胶杂化整体柱在一定程度上能解决柱材料稳定性和多样性结合问题，因此具有很大发展前景，但是目前这类整体柱相关研究不多，应用也有限，基于这种情况，本文中我们基于杂化技术展开硅基整体柱多元化研究及应用。主要内容如下：首先以纯硅胶整体柱（TMOS整体柱）为研究对象，详细考察了体系中致孔剂PEG、脲以及温度对整体柱结构的影响，我们进一步以VTMS杂化整体柱为研究对象考察了添加有机硅烷后，制备体系中PEG，脲以及温度对整体柱结构的影响。基于上述研究结果，用甲基丙烯酰氧乙基三甲氧基硅烷（γ-MAPS）替代乙烯基三甲氧基硅烷（VTMS）作为前驱体合成γ-MAPS-TMOS杂化整体柱。相比VTMS杂化整体柱，γ-MAPS-TMOS杂化整体柱表面含有高反应活性烯键，因而能在更温和条件下跟其他含烯键的化合物进行自由基聚合，以及跟含巯基的化合物进行巯-烯点击化学反应，从而将各种分子固定到整体柱表面。酶固定化一直是生化研究者们关注的焦点，其容易变性的弱点对固定化基质和反应提出了很高的要求，本部分中我们采用前一工作中发展的γ-MAPS-TMOS杂化整体柱作为固定基质，通过巯-烯点击化学反应将胰蛋白酶固定在γ-MAPS整体柱上制成酶微反应器，γ-MAPS-TMOS杂化整体柱表面包含的烯键为高活性烯键，因而能够在常温下高效的和酶表面的自由巯基发生反应而将酶键合到整体柱表面。最后我们将制备的酶反应器应用到蛋白的在线酶解中，结果表明具有较好的酶解效率。我们发展了一种以VTMS杂化整体柱为基础的新型的双相杂化整体柱，整体柱的前段通过在VTMS杂化柱预聚液中添加含磺酸基的高分子单体和引发剂的方法引入阴离子聚合物，后段为不添加高分子单体的VTMS杂化整体柱，通过一步法将聚合物有机硅胶杂化整体柱和VTMS杂化柱无缝连接在一起，由于后段表面含未反应双键，因而可以通过巯-烯点击反应键合不同的功能基。合成的双相整体柱应用于柱上同时富集、分离碱性化合物。进一步蛋白水解物富集分离试验表明该双相整体柱能够应用于复杂体系富集与分离的研究。基于乙烯基杂化整体柱除采用表面衍生的办法改性表面外，还可以通过一步法合成得到表面含高分子链的聚合物有机硅胶杂化整体柱，但是通常添加单体性质对整体柱孔结构形成具有影响，本章以水溶性可离子化单体为对象，研究了添加不同性质单体时，在保证整体柱形成良好孔结构的前提下，影响单体添加量的决定性因素，研究结果表明，对于强酸性单体和磺酸基两性离子单体在中性盐的状态下有利于增加单体添加量，与之不同的是季铵类单体则在酸性较强的条件下有利单体的添加。通常水解酸为弱酸，因此弱酸单体可以以水解酸的身份大量的添加到预聚合液中。弱碱性单体添加规律受多种条件的综合影响。通过这些规律的研究使得我们能够可控地制备此类杂化整体柱，也为其他类型聚合物有机硅胶杂化整体柱制备提供参考。两性离子由于其强亲水性一直备受研究者们的关注，基于两性离子单体，目前已经发展了多种有机基质的亲水整体柱，但是亲水分离中高浓度有机相常常容易导致有机柱的溶胀。在第五章中我们以磺酸基两性离子单体（N,N-二甲基-N-甲基丙烯酰胺基丙基-N,N-二甲基-N-丙烷磺酸内盐，DMMPPS）为添加单体合成了poly（DMMPPS）有机硅胶杂化整体柱，与有机基质相比这种杂化基质能在高浓度有机相中保持更好的机械稳定性。在本章中对poly（DMMPPS）有机硅胶杂化整体柱进行了详细的亲水性评价，并应用于酸性、碱性、中性小分子以及蛋白酶解物的亲水分离。结果表明poly（DMMPPS）有机硅胶杂化整体柱具有较强亲水性和优异的分离性能，且具有分离复杂性亲水化合物的潜力。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-14
第1章绪论  14-36
  1.1 微分离技术概况  14
  1.2 微柱技术简介  14-17
    1.2.1 毛细管电泳技术  14-15
    1.2.2 微柱液相色谱技术  15-16
    1.2.3 微柱的分类及比较  16-17
  1.3 整体柱制备原理、分类及其应用  17-19
    1.3.1 整体柱制备原理-聚合诱导相分离  17
    1.3.2 聚合反应与整体柱分类  17-19
  1.4 基于自由基诱导聚合相分离的有机整体柱制备  19-25
    1.4.1 疏水有机整体柱  19-20
    1.4.2 亲水有机整体柱  20-23
    1.4.3 自由基聚合诱导相变法制备有机无机杂化整体柱  23-24
    1.4.4 引发剂  24-25
    1.4.5 溶剂体系  25
  1.5 缩合聚合诱导相分离制备 TMOS 整体柱  25-29
    1.5.1 熵驱动相分离成孔体系  26-28
    1.5.2 焓驱动相分离成孔体系  28-29
  1.6 缩合聚合诱导相分离制备有机硅胶杂化整体柱  29-31
  1.7 自由基聚合+硅烷缩合聚合协同诱导相分离制备聚合物有机硅胶杂化整体柱  31-32
  1.8 整体柱应用  32-33
  1.9 本论文工作  33-36
第2章溶胶凝胶法制备烯基杂化整体柱  36-49
  2.1 前言  36-37
  2.2 实验部分  37-38
    2.2.1 试剂和材料  37
    2.2.2 石英毛细管的预处理  37
    2.2.3 TMOS 整体柱的制备  37
    2.2.4 VTMS 杂化整体柱的制备  37-38
    2.2.5 γ-MAPS-TMOS 杂化整体柱制备  38
    2.2.6 杂化整体柱的形态表征  38
  2.3 结果与讨论  38-47
    2.3.1 TMOS 整体柱制备条件变化对整体柱孔结构的影响  38-41
    2.3.2 VTMS 整体柱制备条件变化对整体柱孔结构的影响  41-44
    2.3.3 γ-MAPS-TMOS 杂化整体柱的制备  44-47
  2.4 小结  47-49
第3章基于烯基杂化整体柱的酶微反应器的制备及其在在线酶解-分离中的应用  49-63
  3.1 前言  49-50
  3.2 实验部分  50-53
    3.2.1 材料与试剂  50-51
    3.2.2 仪器  51
    3.2.3 γ-MAPS-TMOS 杂化整体柱制备过程  51
    3.2.4 胰蛋白酶中双硫键的还原与酶的固定化  51-52
    3.2.5 γ-MAPS-TMOS 杂化硅胶整体柱的形态表征  52
    3.2.6 γ-MAPS-TMOS 杂化硅胶整体柱表面功能基团的红外分析  52
    3.2.7 酶在γ-MAPS-TMOS 杂化硅胶整体材料表面键合密度分析  52
    3.2.8 酶活测定  52
    3.2.9 毛细管电泳分析  52-53
    3.2.10 蛋白样品的在线酶解与分离  53
  3.3 结果与讨论  53-62
    3.3.1 γ-MAPS-TMOS 杂化整体材料的表征  53-56
    3.3.2 巯-烯点击化学固定胰蛋白酶  56-58
    3.3.3 有连接臂固定与无连接臂固定酶的活性的测定  58-61
    3.3.4 蛋白的酶解与分离  61-62
  3.4 小结  62-63
第4章双相有机无机杂化整体柱在线富集系统的建立及其应用  63-83
  4.1 前言  63-65
  4.2 实验部分  65-67
    4.2.1 药品和试剂  65
    4.2.2 双相杂化整体毛细管柱制备  65
    4.2.3 双相杂化整体柱表面的荧光表征  65-66
    4.2.4 双相杂化整体柱的表面修饰  66
    4.2.5 双相杂化整体柱的表面形貌的表征  66
    4.2.6 通透性实验  66
    4.2.7 牛血清蛋白的酶解  66
    4.2.8 富集与毛细管电泳分离  66-67
  4.3 结果与讨论  67-82
    4.3.1 双相杂化整体柱制备及表征  67-70
    4.3.2 双相杂化整体柱电渗流的评价  70-71
    4.3.3 分离段键合的功能基团对分离的影响  71-72
    4.3.4 工作缓冲液对分离的影响  72-75
    4.3.5 分离段长度对分离效果的影响  75
    4.3.6 系统富集的影响因素  75-76
    4.3.7 进样时间对分析物富集的影响  76-77
    4.3.8 样品基质对分析物富集的影响  77-78
    4.3.9 重复性与稳定性  78-79
    4.3.10 SPMA-VTMS 杂化柱的吸附容量  79-80
    4.3.11 多肽的富集应用  80-82
  4.4 小结  82-83
第5章有机无机杂化整体柱合成中单体性质对整体柱制备条件的影响  83-99
  5.1 前言  83-85
  5.2 实验部分  85
    5.2.1 试剂及化学品  85
    5.2.2 聚合物有机硅胶杂化整体柱的制备  85
    5.2.3 聚合物有机硅胶杂化整体柱的形态表征  85
  5.3 结果与讨论  85-97
    5.3.1 酸性单体杂化整体柱制备  86-89
    5.3.2 两性离子类单体  89-91
    5.3.3 含氮类单体  91-97
  5.4 小结  97-99
第6章基于改进的磺酸基甜菜碱杂化硅胶整体柱在极性化合物分析中应用  99-115
  6.1 前言  99-100
  6.2 实验部分  100-102
    6.2.1 试剂及化合物  100
    6.2.2 磺酸基甜菜碱杂化毛细管整体柱的制备  100-101
    6.2.3 杂化整体柱的形态表征  101
    6.2.4 牛血红蛋白的酶解  101
    6.2.5 通透性实验  101
    6.2.6 Nano-LC 分析程序  101-102
  6.3 结果与讨论  102-114
    6.3.1 DMMPPS 有机硅胶杂化整体柱的制备及表征  102-105
    6.3.2 Poly（DMMPPS）有机硅胶杂化整体柱的机械稳定性研究  105-106
    6.3.3 poly（DMMPPS）有机硅胶杂化整体柱亲水分离性能评价  106-109
    6.3.4 DMMPPS 添加量对核苷分离的影响  109
    6.3.5 流动相中 ACN 对核苷化合物在整体柱上保留值的影响  109-110
    6.3.6 离子强度对核苷保留因子的影响  110-111
    6.3.7 poly（DMMPPS）有机硅胶杂化整体柱在其他极性化合物分析中应用  111-114
  6.4 小结  114-115
结论  115-117
参考文献  117-136
附录 A 攻读学位期间发表的学术论文目录  136-137
致谢  137

基于烯基桥联反应多分离特性杂化整体柱研究

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