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固定化酶微反应器和混合基体应用于MALDI TOF-MS的肽谱分析和小分子分析
作 者: 郭忠
导 师: 邹汉法;国宝川
学 校: 中国科学院研究生院(大连化学物理研究所)
专 业: 分析化学
关键词: 基体辅助激光解吸质谱 固定化酶微反应器 肽谱分析 小分子分析 有机基体信号抑制
分类号: O657.63
类 型: 博士论文
年 份: 2003年
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内容摘要
以各种软电离技术为手段的生物质谱的兴起标志着质谱学从近代结构和分析化学领域进入生命科学范畴。基体辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)作为生物质谱最主要的组成部分之一,由于其分析速度快、灵敏度高、适合于复杂体系分析及抗杂质干扰能力强的特点,成为当前质谱领域中的研究热点。 本论文利用熔融石英毛细管为载体,制备了共价键合及金属螯合两种蛋白质水解酶固定化微反应器。利用微反应器水解蛋白样品、质谱检测水解产物然后将所获得的肽质谱图用于蛋白质数据库检索,从而建立了微量蛋白质的快速结构分析和鉴定方法。实验表明这种方法可以对低达9 fmol的蛋白质进行鉴定。 针对常规光谱法测定酶微量反应困难的问题,采用MALDI TOF-MS质谱方法来表征固定化毛细管微反应器酶的活性。以精氨酸及N_α-苯甲氧羰基-L-精氨酸为内标物首先考察了MALDI质谱定量分析能力,同时通过对质谱法和常规分光光度法测定胰蛋白酶活性的比较,验证了质谱方法的可行性。进而对固定化酶的最适反应pH值、温度、稳定性等性质进行考察,并测定出其反应动力学常数K_m。 针对MALDI分析小分子时常规有机基体信号干扰问题,提出利用在常规基体中加入表面活性剂以抑制基体信号的新方法,成功地进行了低分子量化合物的分析。考察了表面活性剂与基体浓度的比例对质谱分析结果的影响,并对离子化机理进行推测,同时应用这种方法对氨基酸、多肽和药物等小分子进行了分析。此外还考察了该方法定量分析的可行性。
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全文目录
第一章 文献综述 9-46 第一节 基体辅助激光解吸电离飞行时间质谱及其应用 9-29 1.1.1 MALDITOF-MS简介 9-14 1.1.1.1 MALDITOF-MS发展简史 9-11 1.1.1.2 典型MALDI分析步骤及仪器 11-12 1.1.1.3 MALDI基本原理 12-13 1.1.1.4 MALDITOF-MS特点 13-14 1.1.2 MALDI研究进展 14-24 1.1.2.1 离子化机理 14-17 1.1.2.2 基体及辅助添加物 17-19 1.1.2.3 靶体及其表面修饰 19-21 1.1.2.4 样品制备方法 21-23 1.1.2.5 定量方法 23-24 1.1.3 MALDI的应用 24-29 1.1.3.1 蛋白质 25-26 1.1.3.2 核酸 26 1.1.3.3 糖类 26-27 1.1.3.4 高聚物 27-28 1.1.3.5 小分子物质 28-29 第二节 固定化酶与肽谱分析 29-40 1.2.1 固定化酶技术 29-35 1.2.1.1 固定化酶简史 29-30 1.2.1.2 酶的固定化方法 30-33 1.2.1.3 固定化酶性质 33-35 1.2.2 蛋白质肽谱分析 35-39 1.2.2.1 裂解方法 36-37 1.2.2.2 基于分离的肽谱分析 37-38 1.2.2.3 基于MS的肽谱分析 38-39 1.2.3 本论文工作 39-40 参考文献 40-46 第二章 固定化酶毛细管微反应器的制备 46-58 第一节 引言 46-47 第二节 实验部分 47-52 2.2.1 仪器与试剂 47 2.2.2 毛细管的清洗及蚀刻 47-48 2.2.3 GLYMO-IDA-Silane的合成 48-49 2.2.4 酶共价键合固定化反应 49-51 2.2.5 酶金属螯合固定化反应 51-52 第三节 结果与讨论 52-56 2.3.1 熔融石英毛细管的预处理 52-54 2.3.2 毛细管微反应器中酶的固载量 54-55 2.3.3 GLYMO-IDA-Silane合成的优点 55-56 参考文献 56-58 第三章 固定化酶毛细管微反应器的性能 58-75 第一节 MALDI质谱定量分析N_α-苯甲酰-L-精氨酸 59-65 3.1.1 引言 59 3.1.2 实验部分 59-60 3.1.2.1 仪器与试剂 59 3.1.2.2 实验方法 59-60 3.1.3 结果和讨论 60-64 3.1.3.1 质谱分析重现性的考察 60-62 3.1.3.2 内标物对结果的影响 62-64 3.1.3.3 定量方式对结果的影响 64 3.1.4 小结 64-65 第二节 固定化酶毛细管微反应器的性质 65-73 3.2.1 引言 65 3.2.2 实验部分 65-67 3.2.2.1 仪器与试剂 65-66 3.2.2.2 胰蛋白酶的固定化 66 3.2.2.3 固定化酶的保存 66 3.2.2.4 酶活性测定 66-67 3.2.2.5 酶米氏常数K_m的质谱测定 67 3.2.2.6 质谱分析 67 3.2.3 结果和讨论 67-73 3.2.3.1 游离胰蛋白酶活性两种测定方法的比较 67-69 3.2.3.2 反应条件的影响 69-70 3.2.3.3 稳定性考察 70-71 3.2.3.4 固定化酶的米氏常数测定 71-73 3.2.4 小结 73 参考文献 73-75 第四章 固定化酶微反应器在蛋白质肽谱分析中的应用 75-101 第一节 共价键合酶毛细管微反应器在肽谱分析中的应用 75-91 4.1.1 引言 75-76 4.1.2 实验部分 76-77 4.1.2.1 仪器与试剂 76 4.1.2.2 毛细管酶微反应器酶解蛋白 76-77 4.1.2.3 MALDI质谱测定 77 4.1.3 结果和讨论 77-90 4.1.3.1 共价键合酶固定化毛细管微反应器特点 78-79 4.1.3.2 基体及样品制备方法对测定结果的影响 79 4.1.3.3 马心细胞色素c的肽谱分析 79-84 4.1.3.4 天花粉蛋白的肽谱分析 84-88 4.1.3.5 牛血清白蛋白的肽谱分析 88-90 4.1.4 小结 90-91 第二节 金属螯合酶毛细管微反应器在肽谱分析中的应用 91-100 4.2.1 引言 91 4.2.2 实验部分 91-92 4.2.2.1 仪器与试剂 91 4.2.2.2 毛细管酶微反应器酶解蛋白 91-92 4.2.2.3 MALDI质谱测定 92 4.2.3 结果和讨论 92-99 4.2.3.1 金属螯合固定化酶毛细管微反应器的制备及其特点 92-93 4.2.3.2 酶解时间影响 93-95 4.2.3.3 毛细管微反应器的再生 95-96 4.2.3.4 蛋白质的肽谱分析 96-99 4.2.4 小结 99-100 参考文献 100-101 第五章 基体信号抑制的激光解吸电离质谱(MSLDI) 101-129 第一节 表面活性剂的MALDI分析 102-111 5.1.1 引言 102 5.1.2 实验部分 102-103 5.1.2.1 仪器与试剂 102-103 5.1.2.2 实验方法 103 5.1.3 结果和讨论 103-110 5.1.3.1 样品准备方法比较 103-106 5.1.3.2 离子型表面活性剂 106-107 5.1.3.3 非离子型表面活性剂 107-110 5.1.4 小结 110-111 第二节 利用表面活性剂抑制基体信号分析小分子化合物 111-122 5.2.1 引言 111 5.2.2 实验部分 111-112 5.2.2.1 仪器与试剂 111 5.2.2.2 实验方法 111-112 5.2.3 结果和讨论 112-118 5.2.3.1 基体信号抑制现象 112-114 5.2.3.2 CHCA/CTAB比例对分析结果的影响 114-118 5.2.3.3 MSLDI的检测灵敏度 118 5.2.4 原理推测 118-119 5.2.5 MSLDI的应用 119-121 5.2.5.1 氨基酸、多肽分析 119-120 5.2.5.2 药物分析 120 5.2.5.3 环糊精类 120-121 5.2.6 小结 121-122 第三节 MSLDI的质谱定量分析 122-127 5.3.1 引言 122 5.3.2 实验部分 122-123 5.3.2.1 仪器与试剂 122-123 5.3.2.2 实验方法 123 5.3.3 结果和讨论 123-127 5.3.3.1 重现性考察 123-125 5.3.3.2 内标物影响 125 5.3.3.3 定量方式影响 125-126 5.3.3.4 MSLDI测定固定化酶的米氏常数 126-127 5.3.4 小结 127 参考文献 127-129 英文简写 129-130 个人简历及论文发表情况 130-132 致谢 132
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中图分类: > 数理科学和化学 > 化学 > 分析化学 > 仪器分析法(物理及物理化学分析法) > 质谱分析
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