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节节麦—黑麦杂种和双二倍体的分子和细胞遗传学分析

作　者: 李锁平
导　师: 刘大钧
学　校: 南京农业大学
专　业: 作物遗传育种
关键词: 节节麦黑麦基因组原位杂交双二倍体序列消除胞嘧啶甲基化改变
分类号: S512.5
类　型: 博士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

利用幼胚培养和秋水仙素处理产生了节节麦(Aegilops tauschii,2n=2x=14, DD)和黑麦(Secale cereale,2n=2x=14, RR)间的杂种和双二倍体。节节麦和黑麦正反交结实率和种子发育程度有较大差异,以节节麦作父本,杂交结实率为8.5%,成胚率为3.8%,培养授粉14天后的3个幼胚不能萌发,未能产生杂种植株；以节节麦作母本,杂交结实率为70.1%,成胚率为48.0%,选择授粉后14天、16天的幼胚进行胚培养,成苗率分别为36.0%(9/25)和72.2%(26/36)。利用细胞学和SSR分子标记对杂种植株进行鉴定,表明节节麦-黑麦杂种含有双亲的全套染色体。节节麦-黑麦杂种F1的花粉母细胞(PMCs)在减数分裂MI染色体平均构型为10.84Ⅰ+1.57Ⅱ+0.01Ⅲ。利用原位杂交技术,对杂种花粉母细胞中期Ⅰ染色体进行分析,三价体中R-D-R和D-R-D联会分别占66.7%、33.3%。二价体中D-D、D-R和R-R类型联会的频率分别是8.6%,83.3%和8.2%。杂种中出现D-D、R-R、D-R-D和R-D-R联会方式表明存在染色体组内非同源染色体之间的配对或不同染色体组的非同源染色体间的配对,这可能与节节麦、黑麦基因组内或基因组间非同源染色体存在重复基因和重复序列有关或进化易位有关。利用杂种幼胚愈伤组织诱导和再生技术产生了节节麦-黑麦杂种幼胚无性系,继代培养420天的再生杂种植株表现形态学变异和PMCs减数分裂MI染色体配对频率的提高,其PMCs减数分裂MI染色体构型为7.59Ⅰ+3.10Ⅱ+0.05Ⅲ+0.01Ⅳ。利用原位杂交技术分析表明其染色体结构和数量没有改变。提示体细胞无性系变异可能是增加部分同源染色体配对,增加属间物种间基因交流的一个新途径。节节麦-黑麦杂种秋水仙素加倍的研究结果表明越冬前分孽期进行处理比越冬后的返清期处理有较好的成活率、加倍率和植株结实率。越冬前分孽期对杂种幼苗利用秋水仙素处理16小时(15℃)效果最好。对节节麦-黑麦双二倍体C1到C4代的细胞学和育性研究表明,其体细胞染色体数2n＝28的植株的比例从C1的57.1%提高到C4的92.5%,PMC减数分裂MI二价体数目从11.70提高到12.25,平均结实率从24.5%提高到51.3%,表明该双二倍体逐代趋向稳定。来自不同结实率的C0双二倍体各代的结实率有一定的差异。不同结实率的C0单株,其后代的结实率和最初C0的结实率有关,C0的结实率越高,后代的平均结实率和单株最高结实率也高。利用染色体C-带和基因组原位杂交鉴定了节节麦-黑麦双二倍体的真实性。节节麦-黑麦双二倍体有较好的育性,是结合D和R基因组一体的小麦族中的新物种,开展小麦遗传进化研究和育种利用的四倍体新种质。利用两套分别扩增重复序列和单拷贝序列的酶切组合EcoRⅠ-MseⅠ、PstⅠ-MseⅠ引物对杂种F1和双二倍体的扩增结果发现,基因组的序列变异主要发生于杂种F1,序列消除是主要的。上述两套酶切组合引物扩增带中,节节麦基因组在杂种F1消失带数占其总消失带数的比例分别为70.00%和52.95%;该比例在黑麦中分别为96.90%和81.64%。染色体加倍后,亲本序列变异以很少的频率发生在双二倍体各世代中。MSAP分析表明节节麦和黑麦杂交和加倍能够导致节节麦和黑麦基因组序列甲基化状态改变,主要发生在杂种F1,以甲基化为主；加倍后主要发生在双二倍体的早期世代,在C2代以后,没有检测到甲基化的改变。本研究结果推测节节麦-黑麦双二倍体在细胞学稳定过程中序列遗传改变比表观遗传改变有更密切的相关性。

全文目录

摘要  10-12
ABSTRACT  12-15
第一部分文献综述  15-29
  一植物多倍体的产生和应用  15-19
    1 植物多倍体的起源和人工合成  16-18
      1.1 自然植物多倍体的起源方式  16-17
        1.1.1 体细胞染色体加倍  16
        1.1.2 多精受精  16
        1.1.3 不减数配子产生和参与授精  16-17
      1.2 植物多倍体的人工诱导  17-18
    2 植物多倍体利用  18-19
      2.1 利用多倍体的形态巨大性获得大的果实或营养器官产品  18
      2.2 利用多倍体育性低获得无籽或少籽果实  18
      2.3 利用染色体加倍人工创造新的作物类型  18-19
      2.4 利用多倍体克服远缘杂交的障碍和转移外源基因  19
  二杂交和多倍化过程中的遗传和表观遗传改变  19-29
    1 植物远缘杂交和多倍化中的遗传改变  20-23
      1.1 亲本序列的快速消除和增加  20-22
      1.2 亲本基因组在多倍体中的累加  22-23
      1.3 杂交和多倍化过程中的基因重排  23
    2 远缘杂交和多倍化过程中的表观遗传学变化  23-26
      2.1 DNA的甲基化和基因沉默  23-25
      2.2 核仁显性  25-26
      2.3 亲本转座子等基因的激活  26
    3 杂交和多倍化过程中的遗传和表观遗传改变的机制和意义  26-29
第二部分研究报告  29-84
  第一章节节麦-黑麦杂种和双二倍体的产生和分子细胞遗传学分析  29-64
    引言  29-31
    1 材料和方法  31-33
      1.1 实验材料、药品  31
      1.2 实验方法  31-33
        1.2.1 远缘杂交及组织培养  31
        1.2.2 杂种胚愈伤组织诱导、继代和再生  31
        1.2.3 细胞学观察  31-32
        1.2.4 原位杂交方法  32
        1.2.5 杂种的SSR分子标记  32-33
        1.2.6 加倍方法  33
        1.2.7 Giemsa C-分带  33
    2 结果和分析  33-58
      2.1 节节麦-黑麦杂种的产生、形态和细胞学分析  33-41
        2.1.1 节节麦和黑麦的杂交和胚培养  33-34
        2.1.2 胚培养杂种的形态、育性和细胞学分析  34-37
        2.1.3 SSR分子标记分析  37-38
        2.1.4 杂种花粉母细胞减数分裂中期Ⅰ配对染色体原位杂交分析  38-41
      2.2 胚愈伤组织再生无性系杂种的形态特征和细胞学分析  41-45
      2.3 节节麦-黑麦双二倍体的形态、育性和细胞学鉴定  45-51
        2.3.1 杂种的染色体加倍和双二倍体(C_0)的细胞学观察和育性  45-47
        2.3.2 C_1植株细胞学观察和育性  47-49
        2.3.3 双二倍体的细胞学稳定性和育性  49-51
      2.4 节节麦-黑麦双二倍体核型、C-分带和原位杂交鉴定  51-58
        2.4.1 荆州黑麦的C-带带型  51
        2.4.2 节节麦的C-带带型  51-52
        2.4.3 节节麦-黑麦双二倍体的C-带带型  52-56
        2.4.4 节节麦-黑麦双二倍体的原位杂交鉴定  56-58
    3 讨论  58-64
      3.1 节节麦和小麦族物种杂交的结实性和合适的胚培养时间  58
      3.2 节节麦-黑麦杂种减数分裂染色体的原位杂交所检测的染色体组内非同源染色体配对  58-59
      3.3 节节麦-黑麦杂种幼胚无性系减数分裂染色体高配对变异的机理  59-62
      3.4 节节麦-黑麦杂种染色体加倍时期和双二倍体的细胞学稳定性  62-64
  第二章节节麦-黑麦杂种F_1及双二倍体稳定过程中的基因组变异  64-84
    引言  64-65
    1 材料和方法  65-72
      1.1 实验材料、药品  65
      1.2 实验方法  65-72
        1.2.1 DNA提取和纯化  65-66
        1.2.2 AFLP标记  66-71
          1.2.2.1 酶切  66
          1.2.2.2 连接  66-67
          1.2.2.3 预扩增反应  67
          1.2.2.4 选择性扩增反应  67
          1.2.2.5 变性PAGE凝胶的制备  67-70
          1.2.2.6 电泳  70-71
        1.2.3 MSAP标记  71-72
    2. 结果和分析  72-81
      2.1 节节麦-黑麦杂种和双二倍体的AFLP分析  72-77
      2.2 节节麦-黑麦杂种和双二倍体的MSAP分析  77-81
    3 讨论  81-84
      3.1 节节麦-黑麦杂种和双二倍体遗传改变  81-82
      3.2 节节麦-黑麦杂种、杂种加倍及其双二倍体稳定过程中的甲基化变化  82-83
      3.3 节节麦-黑麦双二倍体稳定性及和序列遗传改变和表观遗传改变的关系  83-84
全文结论  84-86
本论文的创新点  86-87
参考文献  87-100
致谢  100

节节麦—黑麦杂种和双二倍体的分子和细胞遗传学分析

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