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草菇糖苷水解酶家族5纤维素酶的定向改造
作 者: 张达
导 师: 丁少军
学 校: 南京林业大学
专 业: 生物化工
关键词: 纤维素酶 自主复制 定向进化 同源建模 定点突变 热稳定性
分类号: Q946
类 型: 硕士论文
年 份: 2011年
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内容摘要
自然界中纤维素的降解是碳素循环的重要组成部分,这种由微生物主导的纤维素水解,主要是纤维素酶作用的结果。纤维素酶有效降解木质纤维,生物转化纤维素为单糖,从而应用于生物质能源的生产。本研究拟对实验室从草菇(Volvariella volvacea)中克隆的纤维素酶EndoglucanaseI(EGI)进行分子改造,期望得到耐热性提高的纤维素酶EGI突变体,探索EGI结构与功能的关系。从两个方面对EGI进行分子改造:定向进化和定点突变。EGI在毕赤酵母中已实现整合型高表达,但这并不适合定向进化中的应用。本研究成功构建自主复制质粒载体pGAPZaB-PARS1并实现EGI的低水平表达,能够应用于EGI的蛋白质工程中。定向进化技术属于蛋白质工程中的非理性设计。采用ep-PCR对egI基因进行随机突变,双酶切egI突变体连接载体pGAPZaB-PARS1,构建以自主复制型载体携带的EGI突变体文库。采用双层平板法筛选从至少15000个克隆中获得6个耐热性显著提高的EGI突变体EG8-1-1、EG8-1-2、EG8-4-1、EG8-5-1、EG9-7-1和EG9-8-2。其中突变体EG8-4-1、EG8-5-1、EG9-7-1和EG9-8-2为不完整基因,缺少纤维素酶结合域CBD以及部分EGl催化域N端氨基酸残基序列,且EG-9-8-2因突变提前终止,C端还少52个氨基酸残基。6个突变体的粗酶液最适反应温度都由原来的55℃提高到65℃,热稳定性显著提高,65℃保温2hr后酶活力仍保持85%以上而原酶EGI在65℃预处理30min即降为原来的约15%,80℃半衰期大于或等于2hr而原酶EGI在80℃保温5min即丧失全部活力。EG9-8-2热稳定性低于另外5个突变体。定点突变技术属于蛋白质工程中的理性设计。采用同源建模找出EGI的两个谷氨酸残基催化中心E192和E301,将EGI氨基酸序列分别与Thermoascus aurantiacus、Talaromyces emersonii、Penicillium brasilianum产生的糖苷水解酶家族5耐热型纤维素酶EG进行比对,催化中心结构附近氨基酸残基的不同可能是EGI不具有耐热性的原因,利用谷氨酸残基催化中心6A-10A内氨基酸残基序列的不同,设计引物进行定点突变使其序列与Thermoascus aurantiacus、Talaromyces emersonii和Penicillium brasilianum保守性一致,构建了四种不同突变的突变体,其中SD1为单点突变,SD2、SD3和SD4为多点突变。突变体EG-SD1、EG-SD2和EG-SD3最适反应温度为65℃, EG-SD4最适反应温度为50℃。四种突变体热稳定均显著提高,65℃保温2hr后酶活力仍保持90%左右,80℃半衰期约2hr,热稳定性与定向进化结果相似。
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全文目录
致谢 3-4 摘要 4-5 Abstract 5-10 第一章 绪论 10-20 1.1 纤维素酶的来源、分类、结构及协同作用 10-12 1.1.1 纤维素酶的来源 10 1.1.2 纤维素酶的分类 10-11 1.1.3 纤维素酶的结构 11 1.1.4 纤维素酶的催化机制与协同作用 11-12 1.2 纤维素酶的改造 12-13 1.3 酶分子定向改造 13-18 1.3.1 理性设计与非理性设计 13-14 1.3.2 定向进化 14-17 1.3.2.1 体外定向进化技术的起源与发展 14-15 1.3.2.2 定向进化技术表达体系的选择 15-16 1.3.2.3 选择/筛选方法论 16-17 1.3.3 定点突变 17-18 1.3.3.1 定点突变技术的起源、发展与应用 17 1.3.3.2 同源建模(Homology modeling) 17-18 1.4 展望 18-19 1.5 课题研究的意义及内容 19-20 第二章 纤维素酶的定向进化 20-59 2.1 引言 20 2.2 材料 20-22 2.2.1 菌种及载体 20 2.2.2 试剂 20-21 2.2.3 工具酶及试剂盒 21 2.2.4 培养基 21 2.2.5 主要仪器 21-22 2.3 实验方法 22-39 2.3.1 毕赤酵母自主复制质粒载体pGAPZαB-PARS1-EG1的构建 22-28 2.3.1.1 毕赤酵母KM71H基因组的提取 23 2.3.1.2 pGAPZαB-PARS1载体构建 23-27 2.3.1.3 pGAPZαB-PARS1-EGⅠ的构建 27-28 2.3.2 自主复制质粒载体pGAPZαB-PARS1-EGⅠ的验证 28-31 2.3.2.1 质粒碱法大量提取 28-29 2.3.2.2 改进的毕赤酵母感受态制备及电转方法 29-30 2.3.2.3 自主复制质粒载体的验证 30-31 2.3.3 突变文库的构建与筛选 31-35 2.3.3.1 ep-PCR条件的确定 31-32 2.3.3.2 突变文库的构建 32-35 2.3.3.3 突变基因文库电转化KM71H以及耐热型EGⅠ突变体的筛选 35 2.3.4 耐热型纤维素酶EGⅠ突变体的酶学特性及基因序列分析 35-39 2.3.4.1 纤维素酶活力的测定方法 36-38 2.3.4.2 温度对纤维素酶EGⅠ突变体活性和稳定性的影响 38-39 2.3.4.3 纤维素酶EGⅠ突变体的基因序列分析 39 2.4 结果分析与讨论 39-59 2.4.1 毕赤酵母自主复制质粒载体pGAPZαB-PARS1-EG1的构建 39-45 2.4.1.1 毕赤酵母KM71H基因组的提取 39 2.4.1.2 pGAPZαB-PARS1载体构建 39-43 2.4.1.3 pGAPZαB-PARS1-EG1的构建 43-45 2.4.2 自主复制质粒载体pGAPZαB-PARS1-EGⅠ的验证 45-47 2.4.2.1 质粒大量提取 45 2.4.2.2 改进的毕赤酵母感受态制备及电转方法 45-46 2.4.2.3 自主复制质粒载体的验证 46-47 2.4.3 突变文库的构建与筛选 47-51 2.4.3.1 ep-PCR条件的确定 47-48 2.4.3.2 突变文库的构建 48-50 2.4.3.3 突变基因文库电转化KM71H以及耐热型EG1突变体的筛选 50-51 2.4.4 耐热型纤维素酶EGⅠ突变体的酶学特性及序列分析 51-57 2.4.4.1 温度对纤维素酶EGⅠ突变体活性和稳定性的影响 51-53 2.4.4.2 纤维素酶EGⅠ突变体的序列分析 53-57 2.4.5 讨论 57-59 第三章 纤维素酶的定点突变 59-77 3.1 引言 59 3.2 材料 59-60 3.2.1 菌种及载体 59 3.2.2 试剂 59 3.2.3 工具酶及试剂盒 59 3.2.4 培养基 59-60 3.2.5 主要仪器 60 3.3 实验方法 60-64 3.3.1 EGⅠ同源建模(homology modeling) 60 3.3.1.1 模板选择(Template selection) 60 3.3.1.2 建模(Modeling) 60 3.3.2 家族同源分析 60 3.3.3 定点突变的构建 60-64 3.3.3.1 定点突变SD1 61-62 3.3.3.2 定点突变SD2、SD3和SD4 62-64 3.3.3.3 定点突变基因电转化KM71H 64 3.3.4 耐热型纤维素酶EGⅠ突变体的酶学特性 64 3.3.4.1 温度对纤维素酶EGⅠ突变体活性和稳定性的影响 64 3.4 结果分析与讨论 64-77 3.4.1 EGⅠ同源建模(Homology modeling) 64-67 3.4.1.1 模板选择(Template selection) 64-65 3.4.1.2 建模(Modeling) 65-67 3.4.2 家族同源分析 67-69 3.4.3 定点突变的构建 69-74 3.4.3.1 定点突变SD1 69-70 3.4.3.2 定点突变SD2、SD3和SD4 70-72 3.4.3.3 定点突变基因电转化KM71H 72-74 3.4.4 耐热型纤维素酶EGⅠ突变体的酶学特性 74-76 3.4.5 讨论 76-77 第四章 结论 77-78 参考文献 78-81 详细摘要 81-82 Abstract 82
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中图分类: > 生物科学 > 植物学 > 植物生物化学
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