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牛传染性鼻气管炎病毒全基因测序和gE基因缺失株的构建及鉴定

作　者: 吴文浩
导　师: 姚火春
学　校: 南京农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 牛传染性鼻气管炎病毒测序同源重组病毒特性
分类号: S852.653
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious Bovine Rhinotracheitis Virus, IBRV),又名牛Ⅰ型疱疹病毒,坏死性鼻炎病毒,能够侵袭牛的多种组织器官,具有广泛的嗜性,可以引起多种临床疾病如牛传染性鼻气管炎、子宫炎、外阴阴道炎等,有些引起肺部继发性感染会造成致死。病毒感染成年牛后,造成母牛的产奶量下降和流产,肉用牛的成长减缓；对于感染后痊愈的牛,仍有继续排毒的可能,对易感牛群有着潜在的威胁。近年来,该病在我国已逐渐呈现流行蔓延趋势,对我国养牛业造成极大的损失,因此对本病进行研究有着极为重要的意义。牛传染性鼻气管炎病毒属于双股线性DNA病毒。DNA总长约130Kb,其中包含一个长独特区,一个短独特区和两个反向重复序列。该病毒因短独特区的翻转异构而存在两种异构体,此外,反向重复序列中的基因变异较明显。将本实验室分离得到的牛传染性鼻气管炎病毒GD0109在牛肾细胞(MDBK)中扩增培养,之后,使用酚-氯仿抽提的方法提取得到分离株病毒的基因组,用高通量测序得到有意义的分离群(Contig)20个,将其与参考株Bovine herpesvirus type1.1complete genome (GenBank: AJ004801.1)进行比对分析和拼接,发现分离群间有未测通部分,根据测得序列继续设计引物扩增未测通的区域并测序,对分离群间的gap进行修补,进而得到尽量完整的基因组序列。比对分析发现分离株病毒与已公布的序列均不完全相同,说明分离得到一株新的牛传染性鼻气管炎病毒毒株,对于研究该病毒的变异程度和研制针对不同毒株的新型疫苗打下基础。本研究经过分析发现分离株病毒与参考序列同源性高达90%以上,但仍有部分片段如反向重复序列中变异十分明显,说明这个区域容易发生变异,而本试验中分离得到的牛传染性鼻气管炎病毒是一个新的毒株,很有必要进行研究。目前对于牛传染性鼻气管炎的防制没有十分有效的办法,主要依靠疫苗进行预防,新型疫苗现在发展迅速。第一种DNA疫苗就是针对本病的新型疫苗；随即还有对IBRV病毒进行毒力基因的缺失制作的基因缺失疫苗；还有将本病毒当做载体表达外源基因制成的重组活载体疫苗等。本试验根据测得的分离株牛传染性鼻气管炎病毒(GD0109)序列设计引物,扩增得到gE基因两条同源臂,并根据pIRES-EGFP质粒的序列设计引物,使用融合PCR的方法扩增得到CMV-EGFP筛选标记基因；分别将上述片段连接至pUC19载体,得到转移质粒pUC-gEE。之后将质粒转染入接种了分离株病毒的MDCK细胞,用同源重组的方法获得并纯化出重组病毒gE缺失株,命名为rIBRV-A7。本试验通过对重组病毒TCID50的测定,滴度由重组前的106.7下降到了1056,通过空斑形成单位的测定及空斑大小的测量发现重组病毒的空斑直径小于亲本毒株,差异显著,证实了gE缺失毒株毒力下降。通过对重组病毒生长曲线的绘制、遗传稳定性试验证实了本重组病毒稳定性好,不易发生突变。重组前后的病毒分别免疫小鼠,并采血制备免疫血清进行交叉中和试验,发现重组毒制得的血清对亲本毒的中和效价以及亲本毒制得的血清对重组毒的中和效价都达到了27,说明本研究构建的重组病毒有着良好的免疫原性。综合以上几点确定了本重组病毒具有良好的稳定性和免疫原性,并且病毒毒力有所下降,充分说明本试验构建的重组病毒用于制备疫苗的可能性。

全文目录

目录  4-7
摘要  7-9
ABSTRACT  9-11
第一章牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的研究进展  11-23
  1 IBRV简介  11-15
    1.1 病原学  11-12
    1.2 IBRV分子生物学特性  12-14
    1.3 流行病学  14-15
    1.4 培养条件和易感动物  15
    1.5 发病机理  15
  2 IBRV的诊断  15-19
    2.1 临床症状  15-16
    2.2 病理特征  16
    2.3 分离鉴定  16
    2.4 聚合酶链式反应(PCR)  16-18
    2.5 酶联免疫吸附试验(ELISA)  18
    2.6 病毒中和试验(VN)  18-19
    2.7 琼脂扩散试验  19
  参考文献  19-23
第二章基因工程疫苗的研究进展  23-31
  1 基因工程亚单位疫苗  23-24
  2 重组活载体疫苗  24-25
  3 基因疫苗  25-26
  4 基因缺失疫苗  26-27
  参考文献  27-31
第三章牛传染性鼻气管炎病毒的全基因组测序  31-45
  摘要  31
  1 材料  31-32
    1.1 主要生物材料  31-32
    1.2 主要试剂  32
    1.3 主要仪器  32
  2 方法  32-35
    2.1 病毒的扩增培养  32-33
    2.2 病毒基因组的提取  33
    2.3 浓度纯度测定,送公司测序  33-34
    2.4 比对拼接  34
    2.5 PCR引物设计  34
    2.6 PCR条件优化  34-35
  3 结果  35-41
    3.1 病毒的扩增培养  35-36
    3.2 病毒基因组PCR鉴定  36-37
    3.3 病毒的电镜观察  37
    3.4 病毒基因组的准备  37
    3.5 测序结果及分析  37-40
    3.6 引物设计  40
    3.7 PCR及测序  40-41
  4 讨论  41-42
  Abstract  42
  参考文献  42-45
第四章牛传染性鼻气管炎病毒gE缺失株构建  45-61
  摘要  45
  1 材料  45-47
    1.1 主要生物材料  45
    1.2 主要试剂  45-46
    1.3 主要仪器设备  46
    1.4 引物设计  46-47
  2 方法  47-52
    2.1 IBRV的增殖及病毒滴度的测定  47
    2.2 病毒DNA的提取  47
    2.3 质粒的提取  47-48
    2.4 目的片段的扩增与产物回收  48-49
    2.5 PCR产物的T/A克隆  49-50
    2.6 连接产物的转化  50
    2.7 阳性克隆的PCR鉴定和双酶切鉴定  50
    2.8 转移载体的构建  50-51
    2.9 转染  51
    2.10 重组病毒的纯化  51-52
    2.11 重组病毒的PCR鉴定  52
  3 结果  52-58
    3.1 病毒滴度的测定  52
    3.2 各个目的片段扩增  52-54
    3.3 各目的片段T/A克隆的鉴定  54-55
    3.4 各个目的片段依次连接到重组质粒PCR鉴定  55-56
    3.5 重组质粒的酶切鉴定  56-57
    3.6 重组病毒的纯化  57-58
    3.7 重组病毒的PCR鉴定  58
  4 讨论  58-60
  Abstract  60
  参考文献  60-61
第五章重组病毒rIBRV-A7生长特性及其免疫原性的研究  61-75
  摘要  61
  1 材料  61-62
    1.1 细胞和病毒  61
    1.2 试验动物  61-62
    1.3 主要试剂  62
    1.4 主要仪器设备  62
  2 方法  62-64
    2.1 重组病毒的增殖  62
    2.2 重组病毒电镜观察  62
    2.3 重组病毒滴度的测定  62-63
    2.4 噬斑大小的比较  63
    2.5 体外生长曲线的测定  63
    2.6 遗传稳定性试验  63
    2.7 温度对病毒的影响  63-64
    2.8 小鼠免疫血清中和试验  64
  3 结果  64-70
    3.1 重组病毒的增殖  64-65
    3.2 重组病毒电镜观察  65
    3.3 重组病毒滴度测定  65-66
    3.4 噬斑大小比较  66-67
    3.5 体外生长曲线的测定  67-68
    3.6 重组病毒的遗传稳定性试验  68-69
    3.7 不同温度对重组病毒滴度的影响  69-70
    3.8 小鼠免疫血清中和试验  70
  4. 讨论  70-73
  Abstract  73
  参考文献  73-75
全文总结  75-77
致谢  77

牛传染性鼻气管炎病毒全基因测序和gE基因缺失株的构建及鉴定

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