学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

猪流感病毒NS1蛋白关键氨基酸位点对细胞定位及细胞因子表达的影响

作　者: 王柏宁
导　师: 刘永杰；刘惠莉
学　校: 南京农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 猪流感病毒 NS1基因 蛋白定位 IFN-α/β TNF-α 流式细胞
分类号: S852.651
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
下　载: 0次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载
 

内容摘要


猪流感(swine influenza, SI)是由猪流感病毒(swine influenza virus, SIV)引起的一种急性、传染性和群发性呼吸道疾病。NS1(non-structural1)蛋白是病毒重要的调控蛋白,是病毒感染期间重要的毒力因子,通过多种机制抵抗宿主抗病毒应答。对NS1蛋白的研究发现,NS1蛋白影响宿主免疫系统的功能,与NS1蛋白上的特定氨基酸位点密切相关。本研究拟对NS1关键氨基酸位点进行突变,分析表达蛋白对细胞内干扰素(IFN-α/β)和肿瘤坏死因子(TNF-a)的影响,进一步明确NS1抑制干扰素产生机理,为防治猪流感提供理论依据。研究扩增了猪流感病毒A/swine/Shanghai/1/2007(H1N2)分离株NS1基因,克隆到pCAGGS表达载体,构建重组表达载体pCAGGS-NS1,经PCR和酶切鉴定,获得阳性克隆,序列分析表明NS1基因序列正确,无突变。设计引物,分别对42、92、42/92位氨基酸进行突变,构建了pCAGGS-NS1S42P, pCAGGS-NS1D92E pCAGGS-NS1S42P/D92E重组表达载体。提取pCAGGS-NS1、pCAGGS-NS1S42P, pCAGGS-NS1D92E. pCAGGS-NS1S42P/D92E质粒,转染A549和293T细胞,经Western blot鉴定,NS1基因在A549和293T细胞中成功表达。重组质粒转染A549细胞,利用抗NS1多克隆抗体,进行间接免疫荧光检测,观察不同重组表达蛋白的细胞定位情况。结果发现,重组表达蛋白主要分布在细胞核中,少量分布在细胞质中。NS1蛋白与NP蛋白之间的互作研究发现,在pCAGGS-NS1质粒和pCAGGS-NP质粒共转染的293T细胞中,NS1蛋白与NP蛋白存在结合.提取经Poly(I:C)刺激的293T细胞总RNA,以β-actin为内参照,建立检测人源细胞IFN-α/βmRNA和TNF-amRNA的半定量检测方法,用来分析pCAGGS-NS1, pCAGGS-NS1S42P>PCAGGS-NS1D92E,pCAGGS-NS1S42P/D92E重组质粒转染细胞的IFN-α/βmRNA和TNF-amRNA水平；同时用ELISA方法,检测IFN-α/β和TNF-a在细胞中的表达情况。结果,pCAGGS-NS1S42P转染组能够明显增强IFN-β mRNA转录水平,与pCAGGS-NS1组比较差异极显著(P<0.01),IFN-a mRNA转录水平差异显著(0.01<P<0.05),TNF-a mRNA转录水平与pCAGGS-NS1转染组相比差异不显著(P>0.05). pCAGGS-NS1D92E和PCAGGS-NS1S42P/D92E(?)染组与pCAGGS-NS1转染组相比, IFN-a/β和TNF-amRNA水平无明显变化(P>0.05)。ELISA检测显示,PCAGGS-NS1S42P转染组能够明显增高IFN-P在细胞中的表达,与pCAGGS-NS1转染组比较差异极显著(P<0.01),IFN-a表达水平差异显著(0.01<P<0.05)；TNF-a表达水平与对照组差异不显著(P>0.05)。PCAGGS-NS1D92E和pCAGGS-NS1S42P/D92E转染组与pCAGGS-NS1转染组相比,对IFN-a/β和TNF-α的表达水平差异不显著(P>0.05)。目前发现NS1蛋白有两种不同形式,为分析NS1蛋白差异是否影响感染细胞内IFN-α/β和TNF-α的表达,研究选择A/swine/Zhejiangi/1/2007株和A/swine/Shanghai/1/2007株,NS1蛋白分别为219个氨基酸/24kD,230个氨基酸/26kD,分别感染293T细胞,ELISA检测细胞因子表达差异。结果,两株病毒感染组均能明显增高IFN-a/β和TNF-α在细胞中的表达,与未感染组比较差异极显著(P<0.01),但两组之间差异不显著(P>0.05)。将两株病毒分别免疫BALB/c小鼠,48h后用流式细胞仪检测T淋巴细胞CD4+和CD8+水平。结果,与PBS组相比,病毒感染组能明显提高CD4+T细胞亚群的百分率,CD8+T细胞亚群的百分率及CD4+/CD8+比值略有提高,但两感染组之间差异不明显(P>0.05)。

全文目录


摘要  7-9
ABSTRACT  9-11
第一篇 文献综述  11-37
  第一章 猪流感病毒NS1蛋白的研究进展  11-29
    1 猪流感概述  11-13
    2 猪流感病毒编码的蛋白特性  13-17
    3 NS1蛋白结构和功能  17-25
      3.1 NS1蛋白的结构特征  17-19
      3.2 NS1蛋白的功能  19-23
        3.2.1 NS1蛋白抑制宿主细胞蛋白的合成  19
        3.2.2 NS1蛋白促进病毒蛋白的合成与表达  19-20
        3.2.3 NS1蛋白颉颃干扰素及肿瘤坏死因子  20-22
        3.2.4 NS1蛋白影响宿主细胞凋亡  22-23
      3.3 NS1蛋白对流感病毒致病性和毒力的影响  23-25
        3.3.2 NS1蛋白与病毒致病性  23-24
        3.3.3 NS1蛋白与病毒毒力  24-25
    4 NS1蛋白的应用  25-29
      4.1 NS1蛋白在鉴别诊断中的应用  25-26
      4.2 NS1蛋白作为抗病毒治疗的靶点  26
      4.3 NS1基因突变重组病毒对肿瘤的治疗  26-27
      4.4 针对NS1蛋白设计新型疫苗  27-29
  参考文献  29-37
第二篇 试验研究  37-75
  第二章 猪流感病毒A/swine/Shanghai/1/2007株NS1蛋白关键氨基酸位点对细胞定位的影响  37-51
    摘要  37-38
    1 材料与方法  38-43
      1.1 材料  38-39
      1.2 方法  39-43
        1.2.1 NS1及其突变体真核表达载体的构建  39-41
          1.2.1.1 引物设计  39-40
          1.2.1.2 目的基因扩增与回收  40
          1.2.1.3 真核重组质粒的构建  40-41
          1.2.1.4 重组质粒的制备、鉴定及定量  41
        1.2.2 脂质体Lipofectamine~(TM) 2000介导瞬时转染细胞  41
        1.2.3 Westen blot鉴定NS1重组蛋白的表达  41-42
        1.2.4 间接免疫荧光技术分析NS1及其突变体蛋白的细胞定位  42-43
        1.2.5 免疫沉淀分析NS1蛋白和NP蛋白相互作用  43
    2 结果  43-47
      2.1 NS1及其突变体真核表达载体的构建  43-44
      2.2 Westen blot检测NS1及NS1突变体蛋白  44-45
      2.3 NS1及NS1突变体蛋白在真核细胞中的定位分析  45-46
      2.4 免疫沉淀分析NS1蛋白和NP蛋白相互作用  46-47
    3 讨论  47-49
    参考文献  49-50
    Abstract  50-51
  第三章 猪流感病毒NS1蛋白关键氨基酸位点对细胞因子影响  51-63
    摘要  51-52
    1 材料与方法  52-54
      1.1 材料  52
      1.2 方法  52-54
        1.2.1 脂质体Lipofectamine~(TM)2000介导瞬时转染细胞  52-53
        1.2.2 IFN-α/β和TNF-α分析  53-54
          1.2.2.1 提取细胞总RNA  53
          1.2.2.2 RT-PCR扩增IFN-α/β和TNF-α基因  53
          1.2.2.3 ELISA检测IFN-α/β和TNF-α蛋白表达水平  53-54
    2 结果  54-57
      2.1 IFN-α/βmRNA和TNF-αmRNA转录水平  54-56
      2.2 IFN-α/β和TNF-α ELISA检测  56-57
    3 讨论  57-61
    参考文献  61-62
    Abstract  62-63
  第四章 不同毒株NS1蛋白对细胞IFN-α/β和TNF-α表达的影响  63-75
    摘要  63-64
    1 材料与方法  64-65
      1.1 材料  64
        1.1.1 病毒、细胞及实验小鼠  64
        1.1.2 主要试剂和仪器  64
      1.2 方法  64-65
        1.2.1 ELISA试剂盒检测IFN-α/β和TNF-α蛋白  64-65
        1.2.2 BALB/c小鼠免疫及分组  65
        1.2.3 小鼠淋巴细胞分离  65
        1.2.4 流式细胞仪测定T细胞亚群  65
    2 结果  65-68
      2.1 IFN-α/β和TNF-α ELISA检测结果  65-67
      2.2 流式细胞仪测定T细胞亚群  67-68
    3 讨论  68-71
    参考文献  71-73
    Abstract  73-75
全文总结  75-77
致谢  77

相似论文

  1. 西施舌精子冷冻保存及其冷冻损伤机理研究,S968.3
  2. 没药甾酮抑制RAW264.7细胞炎症反应的机制研究,R285
  3. 猪流感病毒NS1蛋白间接ELISA检测方法的建立及NS、NP蛋白细胞定位研究,S858.28
  4. 金钗石斛多糖减轻脂多糖诱导的大鼠学习记忆减退及机制研究,R285.5
  5. 葡萄籽原花青素对肾血管性高血压大鼠血压的影响及其机制研究,R544.1
  6. 420nm强脉冲光对痤疮动物模型影响的实验研究,R758.733
  7. 涤痰汤治疗脑卒中后抑郁的临床观察,R277.7
  8. 低温复苏对失血性休克大鼠肺组织PPAR-γ及相关基因表达的影响,R605.971
  9. IL-6、TNF-α在术后肠梗阻动物模型中的表达及中药腑安的保护作用研究,R285.5
  10. 三七总皂甙对兔肺挫伤治疗作用的实验研究,R285.5
  11. 丹星通络汤对大鼠脑缺血再灌注损伤TNF-α、NF-κB表达的影响,R285.5
  12. 大鼠急性胰腺炎相关肺损伤肺脏内源性H2S/CSE体系的变化,R563.8
  13. 抗痛风胶囊下调急性痛风性关节炎大鼠关节软骨中MMP-1、TNF-a蛋白表达,R589.7
  14. 外源褪黑素对LPS致宫内感染胎鼠脑组织氧化损伤及TNF-α表达的影响,R363
  15. IL-6和TNF-α与原发性肝细胞肝癌的Meta分析,R735.7
  16. 东北贯众抗H1N1亚型猪流感病毒有效组分的研究,R285
  17. 猪流感病毒表位抗原基因串联表达及小鼠免疫试验,S852.65
  18. 猪流感病毒和“猪—禽”流感重配病毒的拯救及其生物学特性的研究,S855.3
  19. 异基因造血干细胞移植患者血管生成素的水平变化与内皮细胞损伤相关性的临床研究,R733
  20. Bmi-1通过抑制INK4A-ARF靶点促进胰腺癌发生的实验研究,R735.9
  21. 17β-雌二醇对人子宫内膜癌细胞的增殖及P21ras和P-ERK表达的影响,R737.33

中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜微生物学（兽医病原微生物学） > 家畜病毒学 > 猪瘟病毒
© 2012 www.xueweilunwen.com