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两株土壤链霉菌次级代谢产物谱分析及吡啶霉素生物合成基因pyr2的功能研究

作　者: 魏茂龙
导　师: 林双君
学　校: 上海交通大学
专　业: 生物工程
关键词: 天然产物 土壤链霉菌 β-咔巴啉碱 吡啶霉素 生物合成
分类号: Q93
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


放线菌尤其是链霉菌在产生抗生素方面具有独特的优势，目前分离到的链霉菌主要来源于土壤，从土壤链霉菌分离到的大部分抗生素至今仍然被广泛使用。此外，微生物次级代谢产物可通过大批量发酵进行大量生产，无原材料后顾之忧。本论文第一部分是以两株土壤链霉菌YIM48915和YIM48924作为出发菌株进行微生物来源天然产物的研究，这两株菌都分离自我国西南森林土壤，其中YIM48915具有很好的抗菌活性，能够抑制金黄色葡萄球菌、变铅青链霉菌和红酵母的生长。通过以次级代谢产物的特殊紫外吸收峰作为筛选标准，分别选择了合适的发酵培养基并进行了大批量发酵。每株菌发酵20L，通过萃取、柱层析、液相制备等分析分离方法最终从YIM48915中得到了4个化合物，分别是15-1、15-2、15-3、15-5，而从YIM48924中只分离纯化了一个化合物24-1。利用光谱技术鉴定了从YIM48915中分离纯化的4个化合物的结构。化合物15-1，6,7-二氯代-1-甲基色氨酸是新结构化合物，该化合物可能是其他次级代谢产物的生物合成前体，而化合物15-5可能是化合物15-1的衍生物，6,7-二氯代-1-甲基吲哚3-羧酸，化合物15-3为β-咔巴啉碱类化合物，化合物15-2是Angucycline类抗生素Rabelomycin。可见，YIM48915菌株可以产生结构多样的化合物。本论文还对吡啶霉素生物合成过程中关键基因pyr2基因功能进行了初步研究。首先对吡啶霉素链霉菌中pyr2缺失突变株HTT12发酵产物进行了LC-MS分析，二级质谱分析表明该突变株可能产生吡啶霉素的异构体HTT12-1。通过大批量发酵和化学分析、分离技术，最终分离到化合物HTT12-1，通过波谱技术鉴定该化合物的确是吡啶霉素的一个同分异构体，可能是吡啶霉素生物合成的中间体化合物。此外，还分离到两个其他的吡啶霉素类似物HTT12-2和HTT12-3。然后以HTT12-1作为底物，以Pyr2蛋白作为催化剂进行体外酶催化反应，但终产物的LC-MS分析未检测到预期化合物的产生。推测可能是体外酶催化反应的条件不合适，或者化合物HTT12-1并非是Pyr2蛋白的直接底物。此外，通过分析化合物HTT12-1和化合物HTT12-2的化学结构，可以推测化合物HTT12-2能够被吡啶霉素生物合成的最后一个模块PyrG催化形成化合物HTT12-1。化合物HTT12-1和HTT12-2的鉴定为最终阐明吡啶霉素中烯醇结构的形成机制提供了可能。

全文目录


摘要  5-7
ABSTRACT  7-12
第一章 文献综述  12-24
  1.1 前言  12
  1.2 微生物来源的天然产物的研究现状  12-20
    1.2.1 微生物天然产物概述  12-13
    1.2.2 链霉菌次级代谢产物研究概况  13-15
    1.2.3 微生物来源天然产物的开发策略  15-20
  1.3 吡啶霉素生物合成研究进展  20-23
    1.3.1 吡啶霉素的化学结构  20
    1.3.2 吡啶霉素的活性及作用机理  20-21
    1.3.3 吡啶霉素生物合成研究进展  21-23
  1.4 本课题研究的意义及目的  23-24
第二章 菌株 YIM48915 和 YIM48924 次级代谢产物分离及鉴定  24-46
  2.1 实验材料、试剂及仪器  25-28
    2.1.1 实验材料  25
    2.1.2 本研究主要使用的试剂及耗材  25
    2.1.3 本研究主要使用的仪器  25-26
    2.1.4 本研究中所配制的试剂和 TLC 显色剂  26
    2.1.5 本研究所使用的培养基  26-28
  2.2 实验方法  28-34
    2.2.1 菌体活化及选育  28
    2.2.2 抗菌活性的测定  28
    2.2.3 种子培养及发酵条件的摸索与建立  28
    2.2.4 次级代谢产物的粗提物的制备  28-29
    2.2.5 次级代谢产物的分析及分离  29-33
    2.2.6 化合物结构鉴定  33-34
  2.3 实验流程  34-38
    2.3.1 菌株 YIM48915 的实验流程  34-36
    2.3.2 菌株 YIM48924 的实验流程  36-38
  2.4 实验结果  38-44
    2.4.1 YIM48915 和 YIM48924 选育培养基的确定  38
    2.4.2 YIM48915 和 YIM48924 抑菌活性测定结果  38-39
    2.4.3 YIM48915 和 YIM48924 发酵培养基的确定  39-40
    2.4.4 化合物结构的鉴定  40-44
  2.5 本章小结  44-46
第三章 吡啶霉素生物合成基因 PYR2 的功能研究  46-60
  3.1 实验材料、试剂及仪器  47-50
    3.1.1 实验菌株  47
    3.1.2 本研究中所用试剂  47-48
    3.1.3 本研究所使用的培养基  48-50
  3.2 实验方法  50-54
    3.2.1 吡啶霉素生物合成中间产物的分离提取  50-53
    3.2.2 Pyr2 蛋白的表达及纯化  53-54
  3.3 实验结果  54-58
    3.3.1 吡啶霉素生物合成中间产物的结构鉴定  54-56
    3.3.2 Pyr2 蛋白功能的体外验证  56-58
  3.4 本章小结  58-60
第四章 吡啶霉素链霉菌产黄酮类化合物的分离和鉴定  60-66
  4.1 实验材料、试剂及仪器  60-61
    4.1.1 实验菌株  60
    4.1.2 主要试剂和仪器  60-61
  4.2 实验方法  61
    4.2.1 吡啶霉素链霉菌的发酵  61
    4.2.2 化合物的分离纯化  61
  4.3 实验结果  61-63
    4.3.1 化合物 WT-1 结构的鉴定  61-62
    4.3.2 证实化合物 WT-1 并非来自于发酵培养基  62-63
  4.4 本章小结  63-66
第五章 结束语  66-68
  5.1 主要工作总结  66
  5.2 后续研究工作  66-68
参考文献  68-72
附录 1  72-92
致谢  92-93
攻读硕士学位期间已发表或录用的论文  93

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中图分类: > 生物科学 > 微生物学
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