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南太平洋环流区深海可培养细菌的多样性研究以及两株海洋新菌的分类鉴定

作　者: 李昭
导　师: 张晓华
学　校: 中国海洋大学
专　业: 微生物学
关键词: 南太平洋环流区 深海细菌 可培养细菌 16S rDNA 浒苔缓生菌 卵形玫瑰变色菌
分类号: Q938.8
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


微生物群落结构是其整体功能的基础，一直是微生物生态学研究的重点问题。深海是一个永久低温（热液口除外）、高压、黑暗的极端生态环境，是极端环境微生物的理想来源。南太平洋环流区（South Pacific Gyre, SPG）位于赤道以南、南美洲与澳大利亚之间，是世界上面积最大的环流区。研究表明，这片海域的有机物沉降速率、细胞丰度及微生物代谢活性均低于以往研究过的深海沉积物，南太平洋环流区的沉积物微生物群落结构以好氧菌为主。迄今为止，对这一海域的海底生态系统研究甚少，本研究通过综合大洋钻探计划(IODP，IntergratedOcean Drilling Program)329航次获得南太平洋环流区7个站点的深海沉积物和底层海水样品，对分离纯化的细菌菌株进行了16S rDNA测序鉴定，并分析了其可培养细菌的多样性，对深海沉积物中的部分菌株进行了淀粉酶、明胶酶、酯酶(Tween20、Tween40、Tween80)、纤维素酶等6种酶的活性检测。另外，本文还对2株海洋新菌进行了分类鉴定。从南太平洋环流区7个站点的深海沉积物中共分离出229株细菌，这些菌株属于5个门，50个属，95个种。其中放线菌门（Actinobacteria）有106株，在数量和种类方面均占主导地位；厚壁菌门（Firmicutes）60株，α-变形菌纲（α-Proteobacteria）16株，β-变形菌纲（β-Proteobacteria）4株，γ-变形菌纲（γ-Proteobacteria）39株，拟杆菌门（Bacteroidetes）3株，酵母菌（Yeast）1株；革兰氏阳性菌即放线菌和厚壁菌共占总菌株数的70%。优势属包括微球菌属(Micrococcus，放线菌门)、芽孢杆菌属(Bacillus，厚壁菌门)和微杆菌属(Microbacterium，放线菌门)等8个属；优势种包括云南微球菌(Micrococcusyunnanensis)、南极微球菌(Micrococcus antarcticus)和科氏葡萄球菌(Staphylococcus cohnii)等18个。另外有10株细菌可能为海洋细菌新属或新种。对部分菌株的6种胞外酶活性检测结果显示，许多菌株都具有胞外酶活性，而且在4C的低温下，仍然有许多菌株具有较强的酶活性，其中具有明胶酶和淀粉酶活性的菌株最多。从南太平洋环流区7个站点的底层水中共分离出176株深海细菌，这些菌株属于5个门，31个属，79个种。其中γ-变形菌纲（γ-Proteobacteria）有143株，在数量和种类方面均占主导地位；α-变形菌纲（α-Proteobacteria）7株，β-变形菌纲（β-Proteobacteria）2株，厚壁菌门（Firmicutes）11株，放线菌门（Actinobacteria）6株，拟杆菌门（Bacteroidetes）5株，酵母菌（Yeast）2株。优势属包括假交替单胞菌属（Pseudoalteromonas）、交替单胞菌属（Alteromonas）、弧菌属（Vibrio）和盐单胞菌属（Halomonas）等10个属；优势种包括居珊瑚假交替单胞杆菌（Pseudoalteromonas paragorgicola）、子午盐单胞菌（Halomonas meridiana）和坎氏弧菌（Vibrio campbellii）等12个种。另外有9株细菌可能为海洋细菌新属或新种。从浒苔(Enteromorpha prolifera)暴发时期青岛近海海水中，分离得到两株好氧革兰氏阴性细菌，编号为ZXM100T与ZXM098。细胞呈卵圆形至不规则短杆形，无鞭毛，有聚羟基丁酸酯(PHB)累积，不含菌绿素a。可以生长的NaCl浓度范围为3-9%（w/v），温度范围为22-28oC。主要的脂肪酸种类为C18:1ω7c、C18:0和C16:0。ZXM100T含有的极性脂种类为磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰胆碱(PC)、磷脂(L)和一种无法确认的胺脂质(AL)，主要的呼吸醌为Q-10。16S rDNA相似性分析结果显示，菌株ZXM100T和ZXM098属于红杆菌科(Rhodobacteraceae)。通过本研究结果分析，菌株ZXM100T和ZXM098鉴定为红杆菌科的一个新属新种，将其命名为浒苔缓生菌(Lentibacter algarum)。该种的标准株为ZXM100T(=LMG24861T=CGMCC1.10234T)。标准株的DNA G+C含量为54.6mol%。从黄海近海文昌鱼繁殖区海水中，分离得到一株革兰氏阴性细菌，编号为H50T，氧化酶和过氧化氢酶反应检测为阳性。细胞呈卵圆形，无鞭毛，含菌绿素a，有聚羟基丁酸酯累积。可以生长的温度范围为0-37oC。主要的脂肪酸种类为C18:1ω7c和C16:0，主要的呼吸醌为Q-10。H50T含有的极性脂种类为双磷脂酰甘油(DiPG)、磷脂酰甘油(PG)和一种无法确认的磷脂(L)。DNA G+C含量为57.7mol%。16S rDNA序列比对分析结果显示， H50T与红杆菌科中的海滨海洋居住菌(Pelagicola litoralis) DSM18290T(96.2%)、粘液玫瑰变色菌(Roseovarius mucosus)DSM17069T(95.8%)、嗜压玫瑰变色菌(Roseovarius tolerans) DSM11457T(95.7%)最接近。由系统进化树可以明确看出，H50T明显属于玫瑰变色菌属(Roseovarius)，而不是海洋居住菌属(Pelagicola)。通过本研究结果分析，菌株H50T鉴定为红杆菌科玫瑰变色菌属的一个新种，将其命名为卵形玫瑰变色菌（Roseovarius ovatus），该种的标准株为H50T(=CGMCC1.10799T=JCM17553T)。

全文目录


摘要  5-8
Abstract  8-15
第一章 前言  15-31
  1.1 深海环境的特点  15-16
  1.2 深海微生物多样性  16-22
    1.2.1 深海微生物多样性研究概况  16-18
    1.2.2 深海微生物多样性研究方法  18-20
    1.2.3 深海微生物资源的开发利用  20-22
  1.3 综合大洋钻探计划  22-24
    1.3.1 综合大洋钻探计划简介  22-23
    1.3.2 南太平洋环流简介  23-24
    1.3.3 IODP329 航次简介  24
  1.4 海洋新菌的分类鉴定  24-30
    1.4.1 海洋新菌分类鉴定的原则  25
    1.4.2 海洋新菌分类鉴定的程序  25-30
  1.5 本论文研究的目的与意义  30-31
第二章 南太平洋环流区深海沉积物可培养细菌多样性研究及活性筛选  31-78
  2.1 实验材料与仪器  31-34
    2.1.1 实验试剂与培养基  31-33
    2.1.2 实验仪器  33-34
  2.2 实验方法  34-42
    2.2.1 样品的采集及处理  34-37
    2.2.2 可培养细菌的分离及保藏  37
    2.2.3 菌株基因组 DNA 的提取  37-38
    2.2.4 菌株 16S rDNA 的扩增及纯化  38-39
    2.2.5 菌株 16S rDNA 序列测定  39
    2.2.6 菌株 16S rDNA 序列的克隆  39-40
    2.2.7 菌株 16S rDNA 序列比对及构建系统进化树  40-41
    2.2.8 胞外酶活性及抑菌活性检测  41-42
  2.3 实验结果  42-73
    2.3.1 可培养细菌的菌落计数及表型特征  42-43
    2.3.2 基于 16S rDNA 序列的分类鉴定结果  43-63
    2.3.3 胞外酶活性检测及抑菌实验结果  63-73
  2.4 讨论  73-78
    2.4.1 南太平洋环流区深海沉积物可培养细菌从环流中心到边缘的变化  73-74
    2.4.2 南太平洋环流区深海沉积物中的潜在新菌  74
    2.4.3 南太平洋环流区深海沉积物可培养细菌的多样性  74-76
    2.4.4 南太平洋环流区深海沉积物可培养细菌的优势菌群  76-78
第三章 南太平洋环流区深海底层水可培养细菌多样性研究  78-105
  3.1 实验材料与仪器  78-79
    3.1.1 实验试剂与培养基  78
    3.1.2 实验仪器  78-79
  3.2 实验方法  79
    3.2.1 样品的采集及处理  79
    3.2.2 可培养细菌的分离及保藏  79
    3.2.3 菌株基因组 DNA 的提取  79
    3.2.4 菌株 16S rDNA 的扩增及纯化  79
    3.2.5 菌株 16S rDNA 序列测定  79
    3.2.6 菌株 16S rDNA 序列的克隆  79
    3.2.7 菌株 16S rDNA 序列比对及构建系统进化树  79
  3.3 实验结果  79-100
    3.3.1 可培养细菌的菌落计数及表型特征  79-80
    3.3.2 基于 16S rDNA 序列的分类鉴定结果  80-100
  3.4 讨论  100-105
    3.4.1 南太平洋环流区深海底层水可培养细菌从环流中心到边缘的变化  100
    3.4.2 南太平洋环流区深海底层水中的潜在新菌  100
    3.4.3 南太平洋环流区深海底层水可培养细菌的优势菌群  100-102
    3.4.4 南太平洋环流区可培养细菌群落结构  102-105
第四章 海洋细菌新属新种——浒苔缓生菌（Lentibacter algarum gen. nov., sp. nov.）的分类鉴定  105-127
  4.1 实验材料与仪器  105-108
    4.1.1 实验试剂与培养基  105-107
    4.1.2 实验仪器  107-108
  4.2 实验方法  108-113
    4.2.1 实验菌株及来源  108
    4.2.2 基于遗传学的分类鉴定  108
    4.2.3 菌株表型特征鉴定  108-109
    4.2.4 菌株生理生化特征鉴定  109-112
    4.2.5 菌株化学特征分析  112-113
  4.3 实验结果  113-125
    4.3.1 基于遗传学的分类鉴定  113-115
    4.3.2 基于表型特征的结果  115-116
    4.3.3 生理生化特征  116-121
    4.3.4 化学类特征  121-125
  4.4 讨论与结论  125-127
第五章 海洋细菌新种——卵形玫瑰变色菌（Roseovarius ovatus sp. nov.）的分类鉴定  127-142
  5.1 实验材料与仪器  127-129
    5.1.1 实验试剂与培养基  127-129
    5.1.2 实验仪器  129
  5.2 实验方法  129-131
    5.2.1 实验菌株及来源  129
    5.2.2 基于遗传学的分类鉴定  129
    5.2.3 菌株表型特征鉴定  129
    5.2.4 菌株生理生化特征鉴定  129-130
    5.2.5 菌株化学特征分析  130-131
  5.3 实验结果  131-139
    5.3.1 基于遗传学的分类鉴定  131-134
    5.3.2 基于表型特征的结果  134-135
    5.3.3 生理生化特征  135-137
    5.3.4 化学类特征  137-139
  5.4 讨论与结论  139-142
第六章 总结  142-144
  6.1 全文总结  142-143
  6.2 主要创新点  143-144
参考文献  144-158
致谢  158-159
个人简历  159
已发表、投稿或正在撰写的学术论文  159-161

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中图分类: > 生物科学 > 微生物学 > 微生物生态学和地区分布 > 水生微生物学
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