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大肠杆菌磷酸吡哆醇氧化酶乙酰化位点的突变对酶活性的影响

作　者: 郭红森
导　师: 张先恩
学　校: 华中农业大学
专　业: 微生物学
关键词: 磷酸吡哆醇氧化酶 克隆 表达 突变 酶活力 酶学常数
分类号: Q936
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
下　载: 25次
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内容摘要


大肠杆菌磷酸吡哆醇氧化酶催化磷酸吡哆醇和磷酸吡哆胺氧化形成磷酸吡哆醛,该氧化过程以黄素单核苷酸为中间电子受体,氧气为最终电子受体；该反应是大肠杆菌从头合成磷酸毗哆醛的最后一步,也是大肠杆菌和哺乳细胞中通过补救途径合成磷酸吡哆醛的关键一步。乙酰化修饰普遍存在于胞内的关键代谢酶中,近年来的研究结果显示乙酰化修饰在细胞动力学、细胞凋亡、能量代谢、蛋白质运输和自噬等过程中都发挥重要作用。本实验室早期蛋白质芯片筛选结果表明,大肠杆菌磷酸毗哆醇氧化酶可能具有乙酰化修饰位点,通过Western blotting实验,我们首次确认了大肠杆菌磷酸吡哆醇氧化酶的乙酰化修饰现象,通过质谱进一步的分析,得到了该酶的两个赖氨酸乙酰化修饰位点,分别是72和159位。对不同来源的磷酸吡哆醇氧化酶氨基酸序列进行多重序列比对后发现,72位赖氨酸高度保守,159位赖氨酸的保守性较低。对这两个乙酰化修饰位点分别进行了定点突变,结果表明72位赖氨酸对于大肠杆菌磷酸吡哆醇氧化酶保持酶活力具有关键性作用。在我们构建的72位的四个突变体(K72R, K72Q, K72P和K72A)中,除了K72R之外,其余三个突变体都只保留了小于10%的酶活力,酶学常数也发生了改变；而且该位点的突变还影响了该酶反应的最适pH值,最适温度和热稳定性等基本性质；159位氨基酸定点突变后对该酶活力的影响较小。

全文目录


摘要  7-8
Abstract  8-9
缩略语表  9-10
1 前言  10-21
  1.1 磷酸吡哆醇氧化酶与维生素B_6代谢  10-12
  1.2 磷酸吡哆醇氧化酶的基本性质  12-13
  1.3 磷酸吡哆醇氧化酶的催化性质  13-15
  1.4 磷酸吡哆醇氧化酶活性的调控  15
  1.5 磷酸吡哆醇氧化酶的活性位点结构  15-17
  1.6 赖氨酸乙酰化修饰的研究  17-19
    1.6.1 赖氨酸乙酰化修饰的研究历程  17-19
    1.6.2 乙酰基转移酶和去乙酰化酶  19
  1.7 研究大肠杆菌磷酸吡哆醇氧化酶的重要意义  19-21
2 材料和方法  21-36
  2.1 实验材料  21-23
    2.1.1 菌株  21-22
    2.1.2 PCR引物  22
    2.1.3 培养基  22-23
  2.2 试剂和仪器  23-25
    2.2.1 试剂  23
    2.2.2 常用缓冲液配方  23-25
    2.2.3 实验仪器  25
  2.3 实验方法  25-36
    2.3.1 大肠杆菌W3110基因组的提取  25-26
    2.3.2 大肠杆菌质粒的提取  26
    2.3.3 感受态细胞的制备(CaCl_2法)  26-27
    2.3.4 从大肠杆菌基因组中扩增pdxH基因  27
    2.3.5 突变基因的PCR  27-29
    2.3.6 酶切反应  29
    2.3.7 连接反应  29-30
    2.3.8 大肠杆菌的转化  30-31
    2.3.9 重组质粒的筛选、验证  31
    2.3.10 蛋白质的大量表达与纯化  31
    2.3.11 SDS-PAGE分析蛋白纯度  31-32
    2.3.12 菌种的保存  32-33
    2.3.13 蛋白质的透析  33
    2.3.14 蛋白质浓度的测定及保藏  33
    2.3.15 蛋白质的免疫印迹(Western blotting)检测  33-34
    2.3.16 乙酰化蛋白的质谱鉴定  34-35
    2.3.17 酶活力的测定  35
    2.3.18 酶反应最适pH值和最适温度的测定  35
    2.3.19 热稳定性的检测  35-36
3 结果与分析  36-51
  3.1 大肠杆菌pdxH基因的扩增和表达载体的构建  36
  3.2 大肠杆菌野生型磷酸吡哆醇氧化酶蛋白的诱导表达  36-37
  3.3 大肠杆菌野生型磷酸毗哆醇氧化酶的纯化  37-38
  3.4 大肠杆菌磷酸吡哆醇氧化酶的赖氨酸乙酰化修饰的鉴定  38-41
    3.4.1 Western blotting鉴定磷酸吡哆醇氧化酶的赖氨酸乙酰化修饰  38
    3.4.2 质谱鉴定大肠杆菌磷酸吡哆醇氧化酶的赖氨酸乙酰化修饰位点  38-41
  3.5 不同来源的磷酸吡哆醇氧化酶的多重序列比对  41-42
  3.6 定点突变基因表达载体的构建  42-44
    3.6.1 定点突变基因PCR  42-44
    3.6.2 突变基因表达载体的构建  44
  3.7 突变体蛋白的诱导表达与纯化  44-45
  3.8 野生型和突变体蛋白的酶活力测定  45-47
  3.9 最适反应pH值的测定  47-48
  3.10 最适反应温度的测定  48-49
  3.11 热稳定性检测  49-51
4 讨论  51-53
5 结论  53-54
参考文献  54-63
致谢  63

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中图分类: > 生物科学 > 微生物学 > 微生物生物化学
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