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霍乱弧菌AphB蛋白氧敏感性机理的研究

作　者: 苏萌
导　师: 朱军；钟增涛
学　校: 南京农业大学
专　业: 微生物学
关键词: 霍乱弧菌 LysR型转录调控因子 AphB 突变株 氧敏感性
分类号: Q936
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


霍乱弧菌是一种革兰氏阴性菌,是引起霍乱的病原体,曾经在全世界范围内引起过多次霍乱疾病的大流行,其致病毒力因子主要为两种：霍乱毒素和毒素共调节菌毛。LysR家族转录调控因子是一类在原核生物中普遍存在的转录调控蛋白家族,该家族成员之间具有相似的分子量大小和高度保守的结构域,该结构域包括N端结合DNA的HTH区域,以及结合辅助诱导物的C端结构域,同时C端也是形成二聚体的区域。LysR家族蛋白可以调控原核生物体内的多种生理功能,并且该家族蛋白的调控活性受到环境信号的影响,这些信号作为辅助诱导物与该蛋白的单体结合后改变其构象促进二聚体的形成,进而激活其调控功能,氧浓度感受是该蛋白家族感受的环境信号之一。以往关于氧浓度对LysR家族蛋白功能影响的研究中,仅仅是发现巯基被氧化修饰后会失去蛋白的调控活性,尚未发现其他的机制。霍乱弧菌AphB蛋白属于LysR家族转录调控因子,是霍乱弧菌毒力调控网络中的一个重要因子。已经有研究表明,AphB蛋白的调控活性同样会受到氧压的影响,AphB的C235巯基氧化修饰会抑制蛋白二聚体的形成。由于AphB还需要结合辅助诱导物来发挥作用,所以推测除形成二聚体受氧抑制以外,至少还有结合诱导物的关键位点对感受氧压起到作用。本实验以AphB为研究对象,研究其除巯基氧化修饰以外的新的感受氧压的机制。本实验利用一种新颖的诱变菌株XL1Red对aphB进行随机突变,该菌株在国内目前的蛋白质定向进化的研究中很少用到。将受AphB调控的下游tcpP基因的启动子融合lux报告基因,之后通过检测Lux值,筛选有氧条件下tcpP基因转录量高于野生型的突变株。结果筛选到4株突变株,S267L、M113I、M244I和E213K,能够在有氧条件下激活下游基因转录。实验中筛选到的4株突变株的氨基酸突变位点都是位于AphB蛋白的C端结构域,由于该结构域包含形成二聚体的区域,所以本实验采用细菌双杂交系统,分别研究了4株突变株蛋白单体之间形成二聚体的能力。结果得到E213K在有氧条件下可以形成有活性的二聚体形式,可见该氨基酸位点突变造成了AphB的二聚体形成不受氧浓度影响,在微氧和有氧条件下均有活性。由于4株突变株中除了E213K以外,其余3株对于AphB蛋白二聚体的形成没有影响,考虑到该蛋白C端结构域还有可能具有结合辅助诱导物的功能,所以实验设计通过对AphB野生型和突变体的蛋白晶体结构进行研究,进而比较氨基酸突变对构象的影响。结果得到了AphB蛋白野生型的晶体,同时建立了蛋白的结晶条件,有利于后续研究该蛋白质不同变体的晶体结构,从而阐明其生物学功能。综上所述,本实验成功的筛选到AphB蛋白的4个与氧敏感性相关的氨基酸位点,当这些位点突变后,均可以使AphB蛋白活性对氧的敏感性下降,可见上述氨基酸位点对于AphB蛋白活性的重要性。本实验为进一步研究霍乱弧菌转录调控因子以及LysR家族蛋白,提供了重要的实验依据和参考。

全文目录


摘要  6-8
ABSTRACT  8-10
缩略语  10-11
第一章 文献综述  11-23
  1. 霍乱  11-12
    1.1 霍乱简介  11
    1.2 霍乱的流行概况  11-12
  2. 霍乱弧菌  12-17
    2.1 霍乱弧菌简介及分类  12
    2.2 霍乱弧菌基因组学  12-13
    2.3 霍乱弧菌毒力因子  13-16
    2.4 霍乱弧菌毒力基因的表达调控  16-17
  3. LysR家族转录调控蛋白  17-23
    3.1 LysR家族转录调控蛋白的结构和功能  18-19
    3.2 LysR家族转录调控蛋白的调控模式  19-20
    3.3 霍乱弧菌AphB蛋白  20-23
第二章 霍乱弧菌AphB氧不敏感突变株的筛选  23-37
  1. 材料与方法  24-32
    1.1 菌株与质粒  24-25
    1.2 培养基与培养条件  25
    1.3 实验用酶及试剂  25
    1.4 常规实验方法  25-28
    1.5 aphB基因突变子文库的建立  28
    1.6 AphB氧不敏感突变株的筛选  28-29
    1.7 利用over-lapping PCR方法进行定点突变  29-31
    1.8 筛选到的AphB氧不敏感突变子在霍乱弧菌中的验证  31-32
  2. 结果与分析  32-36
    2.1 AphB氧不敏感突变株的筛选及功能分析  32-33
    2.2 AphB氧不敏感突变株在△aphB缺失突变株中的验证  33-36
  3. 小结与讨论  36-37
第三章 AphB氧不敏感突变的机理研究  37-49
  1. 材料与方法  39-44
    1.1 菌株与质粒  39-40
    1.2 培养基与培养条件  40
    1.3 实验用酶及试剂  40
    1.4 显色实验用试剂及配方  40
    1.5 实验常规方法  40-42
    1.6 T25和T18融合突变aphB基因的重组质粒的构建  42-43
    1.7 细菌双杂交实验方法  43-44
  2. 结果与分析  44-47
    2.1 T25和T18融合突变aphB基因的重组质粒的构建  44-45
    2.2 细菌双杂交实验  45-47
  3. 小结与讨论  47-49
第四章 AphB蛋白晶体结构的研究  49-63
  1. 材料与方法  50-57
    1.1 菌株与质粒  50
    1.2 培养基与培养条件  50
    1.3 实验用试剂及仪器  50-51
    1.4 实验试剂的配制方法  51-54
    1.5 AphB C-terminal His-tag融合蛋白的表达、纯化  54-56
    1.6 AphB C-terminal截短型蛋白的结晶获得  56-57
  2. 结果与分析  57-62
    2.1 AphB C-terminal截短型蛋白纯化结果  57-61
    2.2 AphB C-terminal截短型蛋白的结晶结果  61-62
  3. 小结与讨论  62-63
全文总结  63-65
参考文献  65-71
致谢  71

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中图分类: > 生物科学 > 微生物学 > 微生物生物化学
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