学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

杀念菌素高产菌株的构建

作　者: 王涛
导　师: 陈有君；邓子新
学　校: 内蒙古农业大学
专　业: 发酵工程
关键词: 链霉菌FR-008 杀念菌素 metK,vgb,adpA整合基因 nsdA基因链霉素抗性基因突变株
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 50次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

杀念菌素是一种具有广谱抗真菌活性的七烯大环内酯类抗生素,产生于链霉菌FR-00(8Streptomyces sp. FR-008)或灰色链霉菌IMRU3570(Streptomyces griseus IMRU 3570)。本文以链霉菌FR-008的突变株ZYJ-6作为出发菌株,通过基因工程技术引入农业生物药物模型基因,如引入全局性正调节基因adpAc、前体物合成基因S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因metK、透明颤菌血红蛋白基因vgb和敲除广泛性的抑制基因nsdA,研究了各个基因分别对杀念菌素合成的影响。结果表明:天蓝色链霉菌中的adpA基因与metK基因在ZYJ-6中高效表达使杀念菌素的产量分别提高了10%和40%;vgb基因的异源表达可以促进细胞的生长且杀念菌素的合成量提高了30%;nsdA基因的敲除对杀念菌素的合成没有影响。在此基础上又分析了两两基因整合对该抗真菌素产量的影响,结果在ZYJ-6引入metK,vgb整合基因或metK,adpA整合基因都可以进一步提高杀念菌素的合成量,与出发菌株相比,杀念菌素产量都提高了40%。根据上述结果,我们又构建了metK,vgb,adpA三个基因的整合表达载体,同时采用“核糖体工程技术”进行链霉素、庆大霉素和利福霉素等的抗性突变株的筛选,获得了一株杀念菌素产量进一步提高了40%的链霉素抗性突变株STR-4。最终将metK,vgb,adpA整合基因在链霉素抗性突变株STR-4中进行高效表达,获得了能使杀念菌素产量提高了110%的高产菌株。本研究对于进一步建立高效表达农业生物药物的通用宿主系统,提高其他抗生素的异源表达量具有重要意义。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-9
1 引言  9-16
  1.1 抗生素概述  9
  1.2 大环内酯多烯类抗真菌素简介  9-10
  1.3 抗生素杀念菌素的研究进展  10-11
  1.4 抗生素高产育种技术  11-12
  1.5 本论文的主要研究内容  12-13
  1.6 本论文涉及的相关基因  13-16
2 材料与方法  16-20
  2.1 实验材料  16-17
    2.1.1 菌株  16
    2.1.2 使用质粒  16
    2.1.3 引物  16-17
    2.1.4 培养基  17
    2.1.5 抗生素使用  17
  2.2 实验方法  17-20
3 结果与分析  20-44
  3.1 正调节基因adpAc 对杀念菌素的合成具有正调控作用  20-23
    3.1.1 链霉菌FR-008 中本身是否含有adpA 基因的验证  20
    3.1.2 天蓝色链霉菌adpAc 基因转入链霉菌FR-008 及工程菌株ZYJ-6  20-21
    3.1.3 全局性正调节因子adpAc 的高效表达对杀念菌素合成的影响  21-23
  3.2 链霉菌FR-008 中nsdAF基因的敲除对杀念菌素的生物合成没有影响  23-28
    3.2.1 链霉菌FR-008 基因组中nsdA 基因  23-24
    3.2.2 链霉菌FR-008 中nsdA 基因的敲除  24-26
    3.2.3 nsdAF基因同框缺失菌株的构建  26-27
    3.2.4 nsdAF基因的敲除对杀念菌素的生物合成没有影响  27-28
  3.3 透明颤菌血红蛋白合成基因在ZYJ6 中的表达可以提高抗生素的产量  28-30
    3.3.1 透明颤菌血红蛋白合成基因vgb 转入工程菌株ZYJ-6  28
    3.3.2 VHb 蛋白对菌株ZYJ6 细胞生长和抗生素合成的影响  28-30
  3.4 S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因metK 在ZYJ-6 中的表达可以促进抗生素产量的提高  30-34
    3.4.1 硫腺苷甲硫氨酸合成酶基因metK 转入工程菌株ZYJ-6  30-32
    3.4.2 metK基因的高效表达对杀念菌素合成的影响  32-34
  3.5 链霉素抗性基因突变筛选工程菌株ZYJ-6 高产菌株  34-35
    3.5.1 链霉素抗性基因突变株的制备  34-35
    3.5.2 链霉素抗性基因突变株的筛选  35
  3.6 metK 和vgb 整合基因的高效表达大大促进了杀念菌素的高产  35-37
  3.7 metK 和adpA 整合基因的高效表达进一步提高了杀念菌素合成量  37-40
    3.7.1 metK，adpA 整合基因转入ZYJ6 及链霉菌FR-008  37-38
    3.7.2 metK，adpA 整合基因对杀念菌素合成的作用  38
    3.7.3 STR-4：：pJTU3956 菌株中杀念菌素产量的变化  38-40
  3.8 杀念菌素高产菌株的构建  40-44
    3.8.1 metK，vgb，adpA 整合基因转入ZYJ6 中  40-41
    3.8.2 metK，vgb，adpA 整合基因对杀念菌素合成的作用  41-42
    3.8.3 杀念菌素高产菌株的构建  42
    3.8.4 高产菌株TW4 中杀念菌素产量的变化  42-44
4 讨论  44-46
  4.1 nsdAF 基因的敲除  44
  4.2 透明颤菌血红蛋白提高杀念菌素产量  44
  4.3 链霉素抗性突变筛选杀念菌素高产菌株  44
  4.4 野生型菌株链霉菌FR-008 和双突变菌株ZYJ6  44-45
  4.5 metK，vgb，adpA 的整合基因  45
  4.6 通用宿主的构建  45-46
5 结论  46-47
致谢  47-48
参考文献  48-54
附录  54-56
作者简介  56

杀念菌素高产菌株的构建

内容摘要

全文目录

相似论文