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DNA shuffling提高磷脂酶A1的催化性能

作　者: 马琦亚
导　师: 薛正莲
学　校: 安徽工程大学
专　业: 微生物学
关键词: 蜡样芽胞杆菌 磷脂酶A1 基因组改组 定向进化 DNA改组
分类号: Q936
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


磷脂酶Al (phospholipase A1,PLA1, EC3.1.1.32)是一种专一水解卵磷脂sn-1酰基产生溶血磷脂和自由脂肪酸的酶类。在植物油脱胶、焙烤食品工业、奶制品加工业、蛋黄酱加工业等领域具有广泛的用途。我国在该酶的开发上起步较晚,发展较为滞后。目前工业上所需要的磷脂酶A1还是依靠从国外进口。因此,通过各种育种方法来开发磷脂酶A1菌株是一项很有意义的工作。本文从富油土壤出发,通过菌株在以卵磷脂为唯一碳源的培养基上表现出的水解圈情况筛得一株产磷脂酶菌株W22。气相色谱鉴定产酶类型为磷脂酶A1。经过菌株的形态学观察、生理生化分析以及分子生物学鉴定,确定该菌株为芽孢杆菌属蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)。申请得到的GenBank登录号为：KC178715。通过摇瓶发酵,优化了其发酵产酶的条件。结果表明当初始pH值为8.0、培养温度为32℃、摇床转速为200r/min发酵12h即有最高酶活力,达到9.12U/mL,相对于6.74U/mL的初始酶活力提高了35.3%。对野生菌W22进行了紫外诱变育种和常温室压等离子(Atmospheric and Room Temperature Plasma,ARTP)诱变育种。得到若干株酶活提高且遗传稳定的菌株。以紫外诱变得到的W22-a、W22-g以及等离子诱变筛得的W22-5为原生质体融合育种的菌种来源。考察了原生质体的制备、灭活的条件。从众多融合子中最终筛得一株发酵酶活力高达17.78U/mL的融合子WR-2,菌落形态较W22偏小。采用易错PCR与DNA Shuffling技术构建来自于粘质沙雷氏菌磷脂酶A1基因plaB的突变文库,并根据在磷脂酶A1筛选平板上突变菌株产生晕圈的大小建立了方便快捷的突变文库筛选方法。经一轮易错PCR和两轮DNA改组筛得一株产酶性能较好的突变株M2,酶活力达到23.7U/mL,相对于亲本酶提高了48.13%,而且M2的热稳定性和低pH值稳定性较亲本酶有所改良。经蛋白质序列分析结果表明,一共有6个氨基酸发生了改变,其中166(Gly-Ala)、210(Gly-Ala).187(Gly-Met)和269(Ile-Ala)突变位点距离预测的酶活性中心较近。经分析166、210、和269处的突变可能增强了催化中心的刚性,与突变酶的热稳定性增强有关。通过三维结构对比166(Gly-Ala)处的氨基酸变化引起了酶结构中一个α螺旋的缺失,该结构的变化可能与酶活力的增加有关。本文对磷脂酶A1育种做了大量的探索,尝试了等离子诱变这一新兴诱变技术,亦通过原生质体融合的方法得到了酶活较高的菌株。为磷脂酶育种做了有益探讨。另外,由于实验材料本身的缺陷,基因改组时未能得到多个亲本的嵌合突变体基因。本研究不仅为磷脂酶A1工业化应用奠定了基础,而且为开发高产且具有优良催化性能的磷脂酶A1提供理论依据。

全文目录


摘要  5-7
ABSTRACT  7-14
第1章 绪论  14-24
  1.1 引言  14-15
  1.2 磷脂酶的种类和来源  15-17
  1.3 磷脂酶A1的研究现状  17-18
  1.4 易错PCR  18
  1.5 DNA Shuffling  18-22
    1.5.1 DNA改组技术的产生  18-19
    1.5.2 DNA改组技术的基本原理和步骤  19
    1.5.3 DNA改组的发展和应用  19-22
      1.5.3.1 传统DNA改组的改良  19-20
      1.5.3.2 family shuffling  20
      1.5.3.3 Genome shuffling  20-21
      1.5.3.4 交错延伸过程  21-22
      1.5.3.5 临时模板随机嵌合技术  22
    1.5.4 DNA Shuffling技术的优缺点及展望  22
  1.6 研究的目的、意义及主要内容  22-24
第2章 磷脂酶A1生产菌的筛选  24-36
  2.1 材料  24-25
    2.1.1 主要仪器和药品  24-25
    2.1.2 培养基的配制  25
  2.2 实验方法  25-29
    2.2.1 菌种筛选  25-26
      2.2.1.1 采集土样  25-26
      2.2.1.2 富集培养  26
      2.2.1.3 菌株的初筛  26
      2.2.1.4 菌株的复筛  26
    2.2.2 酶活测定  26-27
      2.2.2.1 磷脂酶A1酶活定性测定  26
      2.2.2.2 磷脂酶A1酶活定量测定  26-27
    2.2.3 菌株产酶定性实验  27
      2.2.3.1 脂肪酸甲酯化方法  27
      2.2.3.2 色谱分析条件  27
    2.2.4 菌株鉴定  27-28
      2.2.4.1 菌株形态学观察及理化分析  27
      2.2.4.2 菌株分子生物学鉴定  27-28
    2.2.5 W22发酵条件优化  28-29
      2.2.5.1 发酵时间对产酶的影响  28
      2.2.5.2 培养温度对产酶的影响  28
      2.2.5.3 初始pH对产酶的影响  28-29
      2.2.5.4 转速对产酶的影响  29
  2.3 结果与分析  29-35
    2.3.1 菌株初筛  29
    2.3.2 摇瓶复筛  29
    2.3.3 菌株产酶的定性  29-30
    2.3.4 菌株鉴定  30-33
      2.3.4.1 菌落形态及其生化特性  30-31
      2.3.4.2 菌株的分子生物学鉴定  31-33
    2.3.5 W22发酵条件优化  33-35
      2.3.5.1 最佳发酵时间  33
      2.3.5.2 最适发酵温度  33
      2.3.5.3 最佳发酵初始pH值  33-34
      2.3.5.4 最优摇床转速  34-35
  2.4 本章小结  35-36
    2.4.1 实验结论  35
    2.4.2 实验讨论  35-36
第3章 基因组改组选育磷脂酶A1高产菌株  36-51
  3.1 实验材料  36-37
    3.1.1 菌种来源  36-37
    3.1.2 主要药品  37
    3.1.3 主要实验设备及仪器  37
    3.1.4 培养基的配置  37
  3.2 实验方法  37-41
    3.2.1 紫外诱变  37-39
      3.2.1.1 菌悬液的制备  37-38
      3.2.1.2 紫外线诱变处理  38
      3.2.1.3 致死率及正突变率的计算  38
      3.2.1.4 筛选方法  38
      3.2.1.5 遗传稳定性考察  38-39
    3.2.2 等离子诱变  39
      3.2.2.1 菌悬液的制备  39
      3.2.2.2 等离子诱变处理  39
      3.2.2.3 菌株的筛选  39
      3.2.2.4 遗传稳定性考察  39
    3.2.3 原生质体融合育种  39-41
      3.2.3.1 生长曲线的绘制  39-40
      3.2.3.2 原生质体的制备  40
      3.2.3.3 原生质体的灭活  40-41
      3.2.3.4 原生质体的融合和再生  41
      3.2.3.5 酶活力的测定  41
      3.2.3.6 遗传稳定性考察  41
  3.3 实验结果和讨论  41-49
    3.3.1 紫外诱变  41-43
      3.3.1.1 致死率和正突变率  41-42
      3.3.1.2 紫外诱变初筛  42
      3.3.1.3 紫外诱变复筛  42
      3.3.1.4 遗传稳定性考察  42-43
    3.3.2 等离子诱变  43-45
      3.3.2.1 致死率和正突变率  43
      3.3.2.2 W22等离子诱变初筛  43-44
      3.3.2.3 W22等离子诱变复筛  44
      3.3.2.4 突变株遗传稳定性验证  44-45
    3.3.3 原生质体融合结果  45-49
      3.3.3.1 生长曲线的绘制  45
      3.3.3.2 原生质体的制备  45-47
      3.3.3.3 原生体的灭活  47
      3.3.3.4 原生质体的融合  47-48
      3.3.3.5 融合子的筛选  48
      3.3.3.6 遗传稳定性实验  48-49
  3.4 本章小结  49-51
    3.4.1 实验结论  49-50
    3.4.2 实验讨论  50-51
第4章 磷脂酶产生菌的DNA改组  51-69
  4.1 实验材料  52-54
    4.1.1 仪器与器材  52
    4.1.2 主要试剂  52-53
    4.1.3 培养基、酶及抗生素  53
    4.1.4 菌种及载体  53-54
  4.2 实验方法  54-59
    4.2.1 质粒的提取  54
    4.2.2 易错PCR  54-55
    4.2.3 DNasel酶切  55-56
    4.2.4 无引物PCR  56
    4.2.5 有引物PCR  56
    4.2.6 突变体文库的构建  56-58
      4.2.6.1 感受态细胞的制备  56-57
      4.2.6.2 酶切及连接转化  57-58
    4.2.7 第二轮DNA Shuffling  58
    4.2.8 阳性克隆的验证  58
    4.2.9 酶活测定  58-59
    4.2.10 突变酶酶学性质的考察  59
      4.2.10.1 最适温度及热稳定性  59
      4.2.10.2 最适pH及pH稳定性  59
      4.2.10.3 金属离子对酶活力的影响  59
    4.2.11 突变体测序与突变位点分析  59
  4.3 实验结果  59-67
    4.3.1 质粒的提取及易错PCR  59-60
    4.3.2 易错PCR  60
    4.3.3 DNA Shuffing  60-62
      4.3.3.1 DNase Ⅰ酶切条件  60-61
      4.3.3.2 无引物PCR和有引物PCR  61-62
    4.3.4 酶切、连接和转化  62-63
    4.3.5 筛选阳性转化子  63-64
    4.3.6 摇瓶复筛及遗传稳定性实验  64
    4.3.7 突变酶酶学性质  64-66
      4.3.7.1 最适温度及温度稳定性  64-65
      4.3.7.2 最适pH及pH稳定性  65
      4.3.7.3 金属离子对酶活力的影响  65-66
    4.3.8 测序结果与突变位点分析  66-67
  4.4 本章小结  67-69
    4.4.1 实验结论  67-68
    4.4.2 实验讨论  68-69
第5章 结论与展望  69-71
  5.1 实验结论  69-70
  5.2 展望  70-71
参考文献  71-76
攻读硕士期间发表论文  76-77
致谢  77

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中图分类: > 生物科学 > 微生物学 > 微生物生物化学
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